溶血性曼氏杆菌（Manniella hemolyticus）又称溶血巴氏杆菌，属巴氏杆菌科曼氏杆菌属，为革兰氏阴性且兼性厌氧菌，是一种条件性致病菌。溶血性曼氏杆菌在牛羊鼻咽和扁桃体中属于正常菌群，当机体防御受到各种应激因素（如运输、营养不良、不利的物理、环境或气候条件以及之前或同时感染某些呼吸道病毒、支原体或其他类型的细菌）损害时均可致病[1-2]。肺炎性巴氏杆菌病是世界范围内分布的牛、绵羊和山羊的重要呼吸道疾病之一，被认为是一种人畜共患疾病，可导致支气管扩张、支气管炎、肺炎、尿路感染、脑脓肿、败血症，通常由甲型溶血性曼氏杆菌引起[3-4]。近年来羊群感染溶血曼氏杆菌引起呼吸道疾病时有发生，对养羊业造成了一定的威胁[5-9]。目前市场上缺乏规范的商品化疫苗预防该病，且该病原菌存在多个抗原，商品化疫苗具有局限性，只能保护部分免疫作用[10]。2021年5月，新疆阿克苏市某养羊场发生疫情，30日龄的羔羊病死率达到20%以上。发病羊主要表现为呼吸困难、流鼻涕、咳嗽、拉稀、体温升高至42 ℃。本研究剖解发病羊，取肺、肝、肠、肠系膜淋巴结等组织，从病原中分离出毒株，通过PCR、16S rRNA鉴定，以期为今后该病的防控工作提供参考。1材料与方法1.1试验材料病料来自新疆阿克苏市某养羊场30日龄羔羊的肺、肝、肠、肠系膜淋巴结。1.2试剂与仪器主要试剂：DNA纯化试剂盒、琼脂糖、Taq DNA 聚合酶、dNTP、DNA Marker（北京全氏金生物技术有限公司）。主要仪器：干式恒温箱（杭州奥盛仪器有限公司）、DK-8D 电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司）、伯乐T100梯度PCR仪（北京智杰方远有限公司）、凝胶成像分析系统（ChemiDoc XRS）。1.3试验方法1.3.1DNA提取精确称取1 g病料加入1 mL PBS溶液放入打碎机打碎5 min，取200~300 μL。按照DNA提取试剂盒说明书提取DNA。引物序列见表1。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.06.005.T001表1引物序列Tab.1Primer sequence名称引物序列片段大小/bpF1GGAATTCCATATGCGACGGCTACCATGCAAGTCG750R1CCGCTCGAGTGTTCAATGTGGTAAGCGCCCTCCC27FAGAGTTTGATCMTGGCTCAG1 4001492RGGTTACCTTGTTACGACTT1.3.2巴氏杆菌PCR扩增以提取的DNA为模板进行PCR扩增。反应体系为：premix Taq (10×Ex Taq Version 2.0) 0.5 μL、10 μmol/Ｌ上游引物1 μL、10 μmol/Ｌ下游引物1 μL、DNA模板5 μL、buffer 2.5 μL、dNTP 1 μL、RNase-free H2O 14 μL。PCR反应条件：98 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，32个循环；72 ℃退火10 min。扩增产物跑电泳观察结果。1.3.316S rRNA扩增以提取的DNA为模板进行PCR扩增。反应体系为：2 × Pro Taq Master Mix 25 μL、10 μmol/Ｌ 27F 1 μL、10 μmol/Ｌ 1492R 1 μL、DNA模板 5 μL、ddH2O 10 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性30 s；98 ℃变性20 s，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，33个循环；72 ℃延伸2 min。扩增产物跑电泳观察结果。1.3.4生物信息学分析使用程序ProtParam、ProtScale、SignalP 4.1Server、NetPhos 3.1 Server和TMHMM Serverv2.0分析溶血曼氏杆菌蛋白的理化性质、疏水性、信号肽、磷酸化位点与跨膜结构域及溶血曼氏杆菌蛋白的二级结构。2结果与分析2.1临床症状及病理变化结果（见图1、图2）患病绵羊体温升高42 ℃，流浆液性、黏液性鼻液，呼吸困难、咳嗽、运动量减少，经常躲在墙角，被毛粗乱，角膜潮红、湿润。由图1、图2可知，发病羊肺脏充血、出血、实变，肝脏瘀血、出血，肠道出血、胆囊充盈、肠系膜淋巴结肿大、出血，胃内含有未消化的乳凝块。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.06.005.F001图1肺脏组织病变Fig.1Pathological changes of lung tissueXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.06.005.F002图2肠系膜淋巴结肿大Fig.2Enlarged mesenteric lymph nodes2.2巴氏杆菌PCR检测结果（见图3）由图3可知，阳性对照和肺脏在750 bp处出现明亮的条带，与预期相符；肝脏、肠、肠系膜淋巴结均未出现明亮的条带，初步说明该病羊感染了巴氏杆菌。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.06.005.F003图3巴氏杆菌PCR检测结果Fig.3PCR test results for Pasteurella注 ： M为DL2000 DNA Marker，1为阳性对照，2为肺脏组织样品。2.316S rRNA检测结果（见图4）自琼脂平板上挑取一个单个菌落作纯培养测序。由图4可知，发病羊感染溶血性曼氏杆菌。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.06.005.F004图416S rRNA检测结果Fig.416S rRNA test result注 ： M为DL2000 DNA Marker，1为挑取菌落，2为阴性对照。2.4溶血性曼氏杆菌蛋白亲疏水性分析（见图5）由图5可知，溶血性曼氏杆菌蛋白由450个氨基酸组成，正负电氨基酸分别为59和47；不稳定系数是46.39，当不稳定系数大于40时，说明该蛋白为不稳定性蛋白。平均亲水值（CRAVY）为-0.580，脂肪族系数为46.14。PoatScale程序对溶血性曼氏杆菌蛋白的亲疏水性分析和平均亲水值判断，该蛋白为亲水性蛋白。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.06.005.F005图5溶血性曼氏杆菌蛋白亲疏水性分析Fig.5Hydrophilicity and hydrophobicity analysis of proteins of M. haemolyticus2.5溶血性曼氏杆菌信号肽、磷酸化位点及跨膜域结构域的预测分析（见图6、图7）由图6、图7可知，溶血曼氏杆菌无信号肽和跨膜结构域，有54个磷酸化位点，其中33个丝氨酸、17个苏氨酸和4个酪氨酸磷酸化位点。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.06.005.F006图6溶血性曼氏杆菌蛋白的跨膜结构域Fig.6Transmembrane domain of proteins of M. haemolyticusXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.06.005.F007图7溶血性曼氏杆菌蛋白的磷酸化位点Fig.7Phosphorylation sites of proteins of M. haemolyticus2.6溶血性曼氏杆菌二级结构预测（见图8）由图8可知，利用SOPMA分析溶血性曼氏杆菌蛋白由α-螺旋、β-转角、无规则卷曲以及延伸链4种结构组成二级结构。无规则卷曲蛋白表结构松散容易与抗体结合，可作为抗原表位，优势区段为：22~24、32~35、60~64、71~75、83~90、108~113、121~131、140~159、164~167、174~180、186~189、196~200、215~217、229~241、249~259、265~273、275~283、288~291、296~300、307~312、325~333、342~358、262~364、378~386、408~436、440~446、448~450。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.06.005.F008图8溶血性曼氏杆菌二级结构预测Fig.8Prediction of the secondary structure of M. haemolyticus3讨论溶血性曼氏杆菌是一种球状短杆菌，菌体两端钝圆，周围可见明显的荚膜，为无鞭毛、无芽孢的革兰氏阴性菌，通常以单一、成对散在排列；瑞氏染色、革兰氏染色或美蓝染色后呈两极浓染。溶血性曼氏杆菌形态与巴氏杆菌相似[1,11-13]，只在反刍动物体内才能够分离到，牛在运输过程中更易发生该病[14]。因此，可推断在应激环境的刺激下可诱发溶血性曼氏杆菌病。溶血曼氏杆菌具有大量的血清型，A1和A2是最优势菌株。A2是导致绵羊发病的最为常见的血清型，A7血清型也可引起绵羊中急性暴发。此次引起羔羊死亡的是血清型A2还是A7，或是其他未被发现的致病性血清型仍需进一步研究。溶血曼氏杆菌在免疫系统中可与其他微生物合作，强化机体的防御功能。当外界环境由于各种原因发生变化，机体的防御系统下降，导致维持机体与共生菌的平衡能力失去平衡，溶血性曼氏杆菌感染机体导致发病[11]。溶血性曼氏杆菌大量繁殖的过程中产生毒力因子，如荚膜、脂多糖、白细胞毒素外膜蛋白等，形成肺静脉、毛细血管和淋巴管血栓，导致肺缺血性坏死和纤维素性渗出物沉积的炎症反应，引发纤维素性肺炎，发病羊出现呼吸困难、流鼻涕和咳嗽等症状，与本研究中患病羊的临床症状相符。本试验利用PCR技术成功扩增出目的基因，得到目的基因片段大小为750 bp，与预期大小相符；通过16S rRNA进行进一步确定，测序结果显示为溶血性曼氏杆菌。从生物信息学分析，溶血曼氏杆菌蛋白揭示，该蛋白无信号肽、跨膜结构域。信号肽标记蛋白质分泌途径和蛋白质目标位置，溶血曼氏杆菌蛋白无信号肽，说明此蛋白无分泌功能。该蛋白为混合性蛋白，稳定性差，发生盘旋和扭曲概率高，和抗体分子结合比例大。因此，该区域可能存在B细胞抗原表位[15-18]。但其他区域或许还存在更多的抗原表位，仍需进一步试验加以确认。4结论本研究通过分子生物学诊断技术和临床症状观察，确定阿克苏某羊场羊可能感染溶血性曼氏杆菌，并利用生物信息学分析该蛋白的特性，为进一步研究该病提供参考。