溶血性曼氏杆菌是一种有荚膜的革兰氏阴性兼性厌氧菌，属巴氏杆菌属。有研究根据DNA杂交及16S rRNA序列的结果建议建立新属，已明确有6个种，其中溶血性曼氏杆菌致病性最强[1]。近年来，我国溶血性曼氏杆菌所导致的感染数量不断增加，成为羊患呼吸道疾病的主要病原菌，易引起严重的并发症导致羊死亡，对养羊业造成了一定损失[2-3]。本研究通过对辽宁省朝阳市某羊场患病羔羊进行鉴定，排除其他病原感染，确定了发病病原为溶血性曼氏杆菌。为了明确该流行菌株的特点，对溶血性曼氏杆菌的致病性、耐药性等特征进行了系统研究和确证，从而为建立诊断方法和防治方案提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1样本采集辽宁省朝阳某羊场从南方引进湖羊6 000只，2020年6月产羔羊约2 000只。2020年7月10日起，羔羊持续发病，发病1周进行统计，羔羊发病率达70%，病死率达45%。在该场采集发病羊羔病例，从患病羔羊肝脏、肺脏等病理变化明显的器官无菌采集病料，分为两份，一份保存于4 ℃冰箱内，一份冻存于-80 ℃冰箱内。1.1.2试剂与仪器主要试剂：营养琼脂培养基（青岛海博生物技术有限公司）、细菌微量生化反应鉴定管（杭州滨和试剂公司）、脱纤维山羊血（北京索莱宝科技有限公司）、细菌DNA提取试剂盒（北京天根试剂有限公司）。主要仪器：超净工作台（苏州净化设备有限公司）、PCR基因扩增仪（Blue Marlin公司）、电泳仪（北京市六一仪器厂）、凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）。1.1.3试验动物锦州医科大学实验动物中心购买体重为18~22 g SPF级昆明小鼠30只。1.2试验方法1.2.1分离病原与形态学观察将病料接种于营养琼脂培养基，恒定温度条件下过夜培养，镜检细菌形态，检验为纯培养物后，-80 ℃保存。1.2.2生化鉴定取纯培养的单个菌落接种至细菌微量生化反应管，培养过夜后观察记录结果。1.2.3分子生物学鉴定按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取细菌DNA，根据GenBank上公布的16S rRNA通用引物，进行PCR扩增，目的片段为1 450 bp。反应体系：2×Taq Master Mix缓冲液25 μL、上游引物2 μL、下游引物2 μL、加入ddH2O补至50 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火 45 s，72 ℃延伸45 s，30~35个循环；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。反应结束后的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察得到符合目的片段大小的条带后，将其送至上海生工生物公司进行测序，测序结果通过在线比对软件进行分析。1.2.4致病性试验1.2.4.1接种菌液的制备选取鉴定纯化后溶血性曼氏杆菌2株进行复苏培养，编号为F3、F4。将复苏后的菌液离心后，采用无菌PBS溶液制成悬菌液[4]。1.2.4.2试验设计将18~22 g SPF级昆明小鼠随机分为3组，每组10只，编号为感染F3组、感染F4组（分别注射分离得到的两株菌株）并设定对照组，均采用腹腔注射方式，试验设计及处理方法见表1。接种后观察7 d，观察记录小鼠的死亡时间、死亡数量以及临床症状，对发病死亡小鼠立即进行剖检，并观察细菌学变化和病理组织学变化。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.05.001.T001表1小鼠致病性试验设计Tab.1Mice pathogenicity test design组别试验动物数/只处理方法感染F3组10菌悬液腹腔注射0.3 mL/只感染F4组10菌悬液腹腔注射0.3 mL/只对照组10不做攻菌处理1.2.5药敏试验及临床治疗效果观察1.2.5.1菌液制备采用无菌棉拭子，挑取纯培养后血平板培养基上的3~5个单菌落，稀释至0.5麦氏单位，以无菌肉汤稀释100倍，混匀[4]。1.2.5.2西药最小抑菌浓度（MIC）的测定选用细菌药敏测定试剂盒进行药敏试验。结果通过美国临床实验室标准化委员会（CLSI）标准判定。1.2.5.3临床治疗效果观察选用其中较为敏感药物对500只发病羔羊进行注射治疗，同时全群口服敏感药物预防，统计治愈率、有效率。2结果与分析2.1分离培养结果（见图1、图2）由图1可知，分离的两株细菌在普通肉汤琼脂培养基上形成边缘整齐、半透明的菌落，新分离的菌落在血平板培养基上呈较弱的β溶血。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.05.001.F001图1血平板上溶血性曼氏杆菌的生长形态Fig.1Growth morphology of Mansonia hemolytica blood plates由图2可知，镜下观察分离株呈两端钝圆、单独、成对的革兰氏阴性短小球杆菌。上述菌体形态均符合溶血性曼氏杆菌的特征。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.05.001.F002图2溶血性曼氏杆菌镜下形态Fig.2Microscopic morphology of Mansonia hemolytica2.2生化试验结果分离到的菌株使葡萄糖、氧化酶、甘露醇、山梨醇、木糖和麦芽糖呈现阳性，使海藻糖、山梨糖、甘露糖呈现阴性，不发酵吲哚和脲酶。上述生化反应结果符合溶血性曼氏杆菌的特征。2.3分子生物学试验结果（见图3）由图3可知，通过PCR扩增与凝胶电泳试验后得到条带大小为1 450 bp，与目的条带符合；PCR产物测序获得了相应的序列，通过Blast比对和同源性分析，与在线公布的溶血性曼氏杆菌同源性达98%以上。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.05.001.F003图316S rRNA PCR鉴定结果Fig.316S rRNA result of PCR注：M为DL2000 marker，阴为阴性对照，F3、F4为检测样本。2.4小鼠致病性试验结果（见表2、图4~图6）由表2可知，攻菌后观察7 d统计发病率及病率，结果显示，感染F3组发病率为100%，病死率为90%；感染F4组发病率为90%，病死率为90%；对照组未见发病。细菌学检验结果显示，试验小鼠所分离的细菌均为溶血性曼氏杆菌，感染F3组阳性率为100%，感染F4组阳性率为90%，对照组全部为阴性，与发病率结果一致。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.05.001.T002表2小鼠致病性试验结果Tab.2Result of mice pathogenicity test组别发病率病死率细菌学检出阳性率感染F3组10090100感染F4组909090对照组000%由图4可知，发病小鼠临床症状主要表现为精神委顿、聚堆；眼球浑浊、眼角有血样分泌物等。由图5可知，主要剖检变化为肺脏充血出血、肝脏变性，有灰白色病灶、脾脏肿大质软、肾脏肿胀褪色、小肠出血。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.05.001.F004图4小鼠典型临床症状Fig.4Typical clinical symptoms of miceXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.05.001.F005图5小鼠典型剖检变化Fig.5Typical pathological of mice由图6可知，发病小鼠的病理组织学变化为肺间隔充血出血，炎性细胞浸润；肝细胞颗粒变性，中央静脉扩张；脾小体淋巴细胞减少、巨噬细胞增多；肾小管上皮变性、结构紊乱；小肠上皮脱落，黏膜固有层和黏膜下层充血、出血，炎性细胞浸润，腺上皮不完整。对照组小鼠无发病和死亡情况。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.05.001.F006图6小鼠病理组织学变化Fig.6Histopathological changes in mice2.5两株溶血性曼氏杆菌对11种抗生素的药敏试验结果（见表3）由表3可知，通过对药物的最小抑菌浓度测定，结果显示，分离菌株对头孢噻呋、四环素、恩诺沙星、氟苯尼考、氧氟沙星、多黏菌素、氨苄西林、大观霉素等抗生素表现敏感，对磺胺异恶唑表现中介，对庆大霉素和安普霉素两种药物则表现耐药。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.05.001.T003表3两株溶血性曼氏杆菌对11种抗生素的药敏试验结果Tab.3Drug susceptibility test result of 11 antibiotics in two strains of Mansonia hemolytica项目敏感数/株敏感标准敏感率/%中介数/株中介标准中介率/%耐药数/株耐药标准耐药率/%四环素2≤21000800≥160氟苯尼考2≤41000800≥160磺胺异恶唑0≤25602—1000≥5120氧氟沙星2≤0.1210000.25~1.0000≥20恩诺沙星2≤0.2510000.50~1.0000≥20多黏菌素2≤21000400≥80氨苄西林2≤810001600≥320庆大霉素0≤400802≥16100大观霉素2≤3210006400≥1280头孢噻呋2≤81000—00≥320安普霉素0≤41000802≥16100注 ：“—”表示无标准。2.6临床治疗效果选用较为敏感的药物头孢噻呋对患病羊注射治疗，全群选用恩诺沙星拌料给药。给药1周后发病死亡情况停止，治愈率达90%，有效率达100%。3讨论目前，羊感染溶血性曼氏杆菌的发病原因主要在于饲养管理条件不佳或饲养环境经常变化，导致羊的抵抗力变弱而引起应激，引发呼吸道疾病发生并加重，严重危害我国绵羊及山羊养殖的有益发展[5]。2003年至2012年，我国新疆、四川、江苏等地均出现了羊感染溶血性曼氏杆菌的病例，且羔羊病死率高于成年羊[6-8]。由此可知，不同地区羊感染溶血性曼氏杆菌的发病率、病死率均有不同。辽宁省朝阳市引进的湖羊品种原产地为南方地区，南北气候不同可能导致羔羊免疫力降低，对溶血性曼氏杆菌耐受力不强，故羔羊病死率高。根据本本研究中小鼠致病性试验结果显示，小鼠的病死率均达到90%以上，侵袭部位涉及呼吸、消化、泌尿及免疫等多个器官或系统，表明该菌具有很强的致病性。使用抗生素是目前对细菌感染治疗与预防的最重要的手段[9]。有研究表明，溶血性曼氏杆菌已对β-内酰胺类、氨基糖苷类及四环素等药物产生了耐药性；冯旭飞等[10]、林裕胜等[11]的研究发现,分离株对头孢噻吩、恩诺沙星、氟苯尼考、环丙沙星、氧氟沙星等大部分药物敏感；而王羽等[12]研究发现，溶血性曼氏杆菌对红霉素、庆大霉素和磺胺间甲氧嘧啶耐药。本次试验结果显示，分离菌株对头孢噻呋、四环素、恩诺沙星、氟苯尼考、氧氟沙星等药物表现敏感，对磺胺异恶唑表现中介，对庆大霉素和安普霉素两种药物表现耐药，与前人的试验结果存在相同之处；但对于抗生素磺胺异恶唑，本次试验结果显示中介，与王羽等[12]的试验结果有所差异。因此，应根据当地气候、发病情况等进行具体分析筛选敏感药物。本试验分离出的溶血性曼氏杆菌显示对多种抗生素均敏感，表明该菌株在刚引进的羊群中耐药性较弱，对多种药物较敏感，故治疗需尽快趁早，防止溶血性曼氏杆菌产生较强的耐药性[13]。经过本研究中药敏试验，筛选出头孢噻呋为治疗溶血性曼氏杆菌的敏感药物，且经临床治疗呈现较好的治疗作用。目前关于溶血性曼氏杆菌病的疫苗制剂的研究也获得了一定成果，如Confer等[14]、董捷[15]采用研究获得的表达产物对犊牛进行免疫，取得了不错的疗效，为溶血性曼氏杆菌的疫苗提供了参考。此外，应加强生物安全管理和科学养殖，减少抗生素或其他化学药物的应用，有效地控制羊溶血性曼氏杆菌的发生，减少或延缓细菌耐药性的产生及传递。4结论试验通过对辽宁省朝阳市某羊场发病羔羊进行临床特征观察及细菌学、分子生物学以及生化鉴定，确定了发病病原为溶血性曼氏杆菌。通过小鼠致病试验，确定了羊溶血性曼氏杆菌辽宁分离株具有较强的致病性；通过药敏试验筛选出对该菌敏感的药物，为羊溶血性曼氏杆菌病未来的研究和建立防控技术提供了一定参考。