泰地罗新（tildipirosin）是英特威-先灵葆雅公司开发的新一代的大环内酯类半合成抗生素，为泰乐菌素的衍生物[1-2]。与其他大环内酯类药物类似，泰地罗新是时间依赖性的抗菌药，可以选择性地结合核糖体亚单位，抑制细菌合成必要的蛋白质。泰地罗新是动物专用的广谱抗菌药，对革兰氏阳性菌和阴性菌均具有较高的抗菌活性，对引起猪、牛呼吸系统疾病（BRD）的病原菌如溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌等敏感性高[3-7]。泰地罗新药效作用强于泰乐菌素、替米考星，在临床使用过程中具有给药剂量低、半衰期长、药效持久且生物利用度高等众多优点[8-10]，在养殖业中具有非常广阔的应用前景。本试验评价泰地罗新注射液给靶动物猪肌注给药后在靶组织中和注射给药部位的残留消除规律，以期为确定制剂的休药期以及其他相关研究提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1主要试剂泰地罗新对照品（含量98.7%，批号：20161128，河北远征药业有限公司自制）、泰地罗新-D10对照品（批号：20-THT-35-5，Toronto Research Chemicals Inc.）、泰地罗新注射液（批号：TILDI-1-03，河北远征药业有限公司）；乙腈、甲醇、正己烷与甲酸（色谱纯，Merck）；磷酸氢二钠、氢氧化钠均为分析纯。1.1.2主要仪器Acquity UPLC-TQD液相色谱-串联质谱仪（Waters）、MS105DU分析天平（感量0.000 01g，Mettler Toledo）、JY5002天平（感量0.01g，上海舜宇恒平科学仪器有限公司）、AM-2组织匀浆机（Nissei公司）、TGL-15B高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）、HMA-50A涡旋混合器（天津恒奥科技发展有限公司）、固相萃取装置（Waters Corporation）、N-Evap 112氮吹仪（Organomation Ass-ociates Inc）、Oasis HLB固相萃取柱（Waters Corporation）。1.1.3溶液配制精密称取10 mg泰地罗新对照品于10 mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，即得浓度为1 g/L的泰地罗新标准贮备液。分别精密量取上述贮备液1.0、0.1 mL于10 mL容量瓶中，加乙腈稀释至刻度，即得成浓度为100、10 μg/mL的标准工作液。1.1.4试验动物试验动物为26头三元杂交健康猪，由北京畜牧总站试验猪场提供。给予不添加抗菌药物的饲料，自由饮水。1.2试验方法1.2.1给药及采样随机选择26头健康猪，其中2头猪不用药，24头猪均按 4 mg/kg·BW剂量肌注给药。2头不用药猪在给药后12 h进行屠宰，24头给药猪分别在给药后12 h以及3、6、9、12、15 d随机选择4头进行屠宰，屠宰后快速采集肌肉、肝脏、肾脏和脂肪等组织样品，以建立的UPLC-MS/MS方法测定所取组织样本中泰地罗新的残留量。1.2.2样品前处理1.2.2.1提取称取（2.00±0.02）g试料，置于50 mL离心管，加入适量泰地罗新-D10内标工作液，再加入乙腈5 mL，涡旋混匀，振荡提取10 min，8 000 r/min离心5 min，转移上清液。残渣中再加入乙腈5 mL，重新提取一次，合并两次提取液于另一离心管中，50 ℃水浴下氮吹浓缩近干。1.2.2.2净化在上述残留物中加入磷酸盐缓冲溶液8 mL，涡旋混匀，超声5 min，采用微孔滤膜过滤。在上述溶液中加入正己烷5 mL，涡旋混匀，5 000 r/min离心5 min，弃去上层有机相，保存下层水溶液。采用甲醇5 mL、磷酸盐缓冲液5 mL活化固相萃取柱，取备用液过柱；采用磷酸盐缓冲液5 mL、5%甲醇水溶液淋洗，真空泵抽干5 min，加入甲醇5 mL进行洗脱。将洗脱液在50 ℃水浴条件下氮吹近干。加入含0.1%甲酸的乙腈-水溶液（5∶95）2.0 mL，涡旋混匀，0.2 μm滤膜过滤，采用液相色谱-串联质谱仪测定。1.2.3色谱条件1.2.3.1液相色谱条件色谱柱：BEH C18 （50.0 mm×2.1 mm，1.7 μm）或相当者；流动相A：0.1%甲酸的乙腈溶液；流动相B：0.1%甲酸的水溶液。梯度洗脱：在0、3.0、4.5、6.0 min时，流动相A依次为5%、30%、90%、5%；流速：0.3 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。1.2.3.2质谱条件离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描（ESI+）；检测方式：多反应监测（MRM）；毛细管电压：1.5 kV；源温：120 ℃；脱溶剂气温度：380 ℃；脱溶剂气流量：500 L/h；碰撞室：氩气3.0×10-3 mbar；定性、定量离子对和锥孔电压及碰撞电压条件见表1。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.05.004.T001表1泰地罗新和泰地罗新-D10特征离子参考质谱条件Tab.1Reference MS conditions for tildipirosin and tildipirosin-D10 characteristic ions组别特征离子对/(m/z)定量离子对/(m/z)锥孔电压/V碰撞能量/eV泰地罗新735.198.1735.198.18646735.1174.260泰地罗新-D方正汇总行10—745.110870401.2.4方法确证1.2.4.1特异性取不同来源的肌肉、肝脏、肾脏空白样品，确定在相应的保留时间对泰地罗新检测是否存在干扰。1.2.4.2标准曲线的制备准确量取适量泰地罗新和泰地罗新-D10标准工作液，采用含0.1%甲酸的乙腈-水溶液（5∶95）稀释成泰地罗新浓度分别为5、20、50、200、500、1 000 μg/L的标准溶液（内标物浓度200 μg/L），供液相色谱-串联质谱仪测定。以泰地罗新标准溶液的浓度为横坐标，以泰地罗新定量离子的峰面积与内标定量离子峰面积的比值为纵坐标，绘制标准曲线。1.2.4.3灵敏度在2 g空白试料中添加适量的标准工作液，进样检测后，计算信噪比，确定检测和定量限，考察方法的灵敏度。1.2.4.4准确度与精密度在猪肌肉、肝脏、肾脏和脂肪空白样品中添加3个不同浓度的泰地罗新，分别为定量限、1/2最高残留量（MRL）、MRL）进行空白添加回收率试验。每个浓度设6个平行样品，重复试验3批，计算回收率及批内、批间相对标准偏差，考察方法的准确度和精密度。2结果与分析2.1方法学验证2.1.1特异性处理猪肌肉、脂肪、肝脏、肾脏空白样品及各组织中添加泰地罗新，目标化合物的保留时间附近无杂质干扰。2.1.2线性范围以泰地罗新标准溶液的浓度为横坐标，以泰地罗新定量离子的峰面积与内标定量离子峰面积的比值为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程为：y=0.874 907 x+15.218 7，相关系数r为0.999 9，表明药物在5~1 000 μg/L的浓度范围内，峰面积与浓度线性关系良好。2.1.3灵敏度泰地罗新在猪肌肉、脂肪、肝脏和肾脏中的检测限为5 μg/kg，在肌肉和脂肪中的定量限为10 μg/kg，在猪肝脏和肾脏中的定量限为20 μg/kg。2.1.4准确度和精密度考察在猪肌肉、脂肪、肝脏和肾脏空白样品中添加定量限、1/2 MRL、MRL浓度的泰地罗新，进行空白添加回收率试验。结果表明，在不同添加浓度水平下，泰地罗新在肌肉、肝脏、肾脏、脂肪中的检测回收率范围为90.2%~108.0%、81.5%~92.3%、82.3%~93.5%和88.5%~102.0%，批内相对标准偏差小于10%，批间相对标准偏差小于15%。2.2肌注给药后组织中泰地罗新的浓度（见表1、图1、图2）由表1及图1、图2可知，按4 mg/kg·BW剂量肌注给药后，泰地罗新在猪各组织中代谢缓慢，猪肌肉、注射部位、肝脏及肾脏组织分别在给药后12 h泰地罗新残留量最高，并逐渐消除，肌肉、肝脏和肾脏组织中泰地罗新在给药后12 h低于MRL值，注射部位泰地罗新残留量在给药6 d后低于MRL值，脂肪组织在给药后3 d泰地罗新残留量最高，在给药6 d后泰地罗新残留量低于MRL值。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.05.004.F001图1猪肌肉、脂肪和肝脏组织样品中泰地罗新残留量平均值Fig.1Average residual value of tildipirosin in pig muscle, fat and liver tissue samplesXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.05.004.F002图2猪肾脏组织和注射部位样品中泰地罗新残留量平均值Fig.2Average residual value of tildipirosin in pig kidney and injection site samples在初始采样时间，泰地罗新在猪各组织中的浓度由高到低为：肾脏注射部位肝脏脂肪肌肉；在给药后15 d，泰地罗新在各组织浓度由高到低为：肾脏注射部位肝脏脂肪肌肉。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.05.004.T002表2猪组织样品中泰地罗新的浓度Tab.2Concentration of tildipirosin in pig tissue samples时间动物编号肌肉注射部位脂肪肝脏肾脏12 h1690.01 959.01 231.01 227.06 333.03836.0834.0625.01 607.07 557.04813.01 245.0954.0959.07 823.07748.01 842.01 699.01 073.06 425.03 d21225.01 143.0674.0501.01 689.022249.0784.01 148.0930.03 507.023260.0432.01 484.01 373.04 887.024243.0441.0587.01 296.05 357.06 d2169.0307.0542.01 061.02 538.05336.0712.0579.01 010.01 858.019159.02 213.0397.01 034.02 252.02065.24 018.0430.0299.01 112.09 d993.81 015.0216.0647.01 670.01080.62 846.0149.0410.01 163.01390.57 416.0461.0588.01 646.01557.83 804.0604.0482.01 205.012 d1275.61 721.0318.0512.01 466.01454.61 492.0277.0495.01 010.01683.52 258.0188.0553.01 132.01739.51 993.0337.0458.0549.015 d736.2842.0135.0322.0712.0835.1644.0182.0332.0909.0942.51 005.055.6266.0561.01840.8109.083.3380.0727.0μg/kg2.3休药期参照欧盟制定的泰地罗新在猪体内的MRL，泰地罗新在猪肌肉、脂肪、肝脏、肾脏和注射部位的MRL值分别为1 200、800、5 000、10 000和7 500 μg/kg。经休药期计算软件WT1.4计算，肌肉、脂肪、肝脏、肾脏中的休药期分别为1.17、9.75、0、2.17 d。结合肌肉、脂肪、肝脏、肾脏中的休药期，将泰地罗新在猪组织中的休药期定为10 d，10 d内注射部位泰地罗新的浓度均低于注射部位的MRL值7 500 μg/kg。3讨论猪呼吸道疾病是全球范围内普遍发生的疾病，其发病率和病死率仍逐年上升，对全球养猪业造成了一定的经济损失[11-12]。猪呼吸道疾病病因复杂，病原众多（包括猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、多杀巴氏杆菌、链球菌、波氏杆菌、圆环病毒、伪狂犬病毒、猪流感病毒、猪瘟病毒、猪后圆线虫、支原体等），易受到转群运输、极端天气、室内温湿度、饲养密度、代谢紊乱、免疫低下等多种因素影响，具有发病率高、病死率高、饲料报酬率低和经济损失严重等特点。因该病病原与诱因较多和易混合感染，难以避免其发生和流行。目前，针对猪呼吸道疾病的治疗方式是给予抗菌药物，泰乐菌素和替米考星等大环内酯类抗生素均有具有较好的治疗效果[13]。但随着大环内酯类等药物的耐药性问题日趋严重，开发新的广谱、高效、优质且安全的抗菌药物势在必行。泰地罗新作为最新动物专用的大环内酯类半合成抗生素，泰地罗新吸收快、达峰时间短、生物利用度高、肺组织浓度高、消除半衰期长、药效持久。单次肌注或皮下注射给药即可提供全程治疗，在兽医临床具有广阔的应用前景[14-16]。在本试验中，泰地罗新按4 mg/kg·BW肌注给药后，在猪体内消除较慢，在肾脏中的残留浓度最高、残留时间最长。欧盟规定，泰地罗新在猪的肌肉、脂肪、肝脏、肾脏和注射部位的MRL分别为1 200、800、5 000、10 000和7 500 μg/kg。采用WT1.4休药期软件对肌注泰地罗新后的休药期进行计算，肌肉、脂肪、肝脏、肾脏中的休药期分别为1.17、9.75、0、2.17 d。结合肌肉、脂肪、肝脏、肾脏中的休药期，将泰地罗新在猪组织中的休药期定为10 d。国外同类产品在猪肌肉和内脏中的休药期为9 d，与本次试验结果基本一致。4结论建立的猪组织样品中泰地罗新残留的超高效液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测方法适用于猪组织样品中泰地罗新残留检测。建议猪肌注泰地罗新注射液后休药期定为10 d。