近年来，过度依赖提高养殖密度和过量投饵的养殖方式使养殖业出现较多问题，导致养殖环境生态失调、病害频发、水资源浪费和污染严重[1]。使用抗生素和化学药物能够暂时抑制病害的发生，但也会产生耐药菌株，造成药物残留、降低养殖动物的免疫力等问题[2]。益生菌能够改善水质，抑制有害菌的生长，保持微生态平衡，是水产动物防控病害的有效手段之一[3]。芽孢杆菌能够形成芽孢，具有耐高温、耐酸碱盐、抗逆性强以及能够分泌多种抗菌物质的能力，是一种具有发展前景的益生菌[4]。目前，关于多种抑制水产病原菌的芽孢杆菌已有报道。展胜[5]筛选出对维氏气单胞菌等12株水产病原菌具有广泛抑制能力的2株贝莱斯芽孢杆菌。朱晶婷等[6]筛选得到的枯草芽孢杆菌对副溶血弧菌具有明显的颉颃作用，且枯草芽孢杆菌浓度越高，颉颃作用越明显。鲁瑞娟[7]从洛阳南陈鱼塘采集的土样中分离获得1株对水产常见病原菌河流弧菌、嗜水气单胞菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌等6种菌具有良好抑菌效果的枯草芽孢杆菌。本试验以多株水产病原菌为研究对象，从鲫鱼肠道样品中分离具有抑制效果的菌株，对其筛选鉴定并进行生物学特性研究，为开发适用于水产养殖的抑菌类微生态制剂提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1分离源与指示剂鲫鱼肠道内容物由山东宝来利来生物工程股份有限公司水产事业部技术人员剖检，将鱼肠道置于无菌试剂瓶中，冷冻保存。嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）、溶藻弧菌（V.alginolyticus）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）均由山东宝来利来生物工程股份有限公司菌种资源中心提供。1.1.2培养基LB液体培养基：蛋白胨1%、酵母膏0.5%、氯化钠0.5%，121 ℃高压灭菌30 min。LB固体培养基：蛋白胨1%、酵母膏0.5%、氯化钠0.5%、琼脂1.5%，121 ℃高压灭菌30 min。2216E液体培养基和2216E固体培养基均购自青岛海博生物。1.2试验方法1.2.1菌株的富集培养与筛选1.2.1.1菌株的富集培养将样品鲫鱼肠道内容物稀释液，接种至LB液体培养基富集培养，37 ℃、200 r/min进行富集培养24 h。分别将各个样品富集培养液200 μL加至LB固体分离培养基平板，涂布均匀，室温静置至干燥，倒置，37 ℃恒温培养。每日观察分离培养基平板中菌落的生长状况，使用已灭菌的牙签挑取尽可能多的单菌落至新的分离培养基平板，对挑取的单菌落进行编号，37 ℃恒温培养24 h。1.2.1.2抑菌性能菌株的初筛采用点种法测定筛选菌株对指示菌的抑菌效果，取200 μL嗜水气单胞菌涂布于细菌培养基平板，制作抑菌菌株指示菌平板，平板标号，使用已灭菌的牙签将上述富集培养后挑取的单菌落一对一接于指示菌平板，倒置于37 ℃恒温培养箱培养24~48 h，根据菌落周围有抑菌圈，判断该微生物是否有抑菌效果。1.2.1.3抑菌性能菌株的复筛采用打孔法测定初筛菌株对指示菌嗜水气单胞菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、维氏气单胞菌的抑菌效果，吸取稀释好的指示菌使用液0.6 mL加入平板，无菌操作吸取15 mL，冷却至约50 ℃灭菌的LB固体培养基和2216E固体培养基，加入至上述已加病原菌的平板中，混匀，平板冷却。使用2.7 mm的直径打孔器，在检测板上垂直均匀打孔，标记菌株编号，在指示菌检测板上每孔分别注入10 μL初筛菌株菌液。正置放置2 h，倒置放于37 ℃培养箱内，培养24 h。每个样品做3个平行。培养结束，检测板上出现抑菌圈，使用游标卡尺测定抑菌圈的直径（cm），取平均值。1.2.2筛选菌株的鉴定1.2.2.1菌株形态观察及生理生化试验通过平板划线法观察菌落形态。取活化的菌株进行革兰氏染色，通过光学显微镜观察菌体及芽孢形态。参照东秀珠等编写的《常见细菌系统鉴定手册》方法，利用细菌微量生化鉴定管对菌株进行生理生化鉴定。1.2.2.2菌株的16S rDNA鉴定采用16S rDNA保守序列的PCR鉴定法和常规生理生化检测试验，16S rDNA保守序列的PCR鉴定法为：细菌16SrDNA扩增的引物序列为：上游：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，下游：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'，序列由上海生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系为：dNTP Mixture 4 μL，5×Prime STAR Buffer 10 μL，上下游引物各0.6 μL，基因组模板0.8 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.6 μL，使用无菌去离子水补充至50 μL。PCR循环参数为：95 ℃、5 min ；94 ℃、1 min，58 ℃、15 s，72 ℃、2 min，30个循环；72 ℃、10 min。将PCR反应产物送至上海博尚生物科技有限公司测序，结果应用DNAStar软件的MegAlign子软件进行分析。通过BLAST序列比对功能选取高相似性的模式菌序列，利用MEGA6.0中的邻接法（Neighbor-Joining Method）构建系统进化树，推测菌株的种属关系。1.2.3菌株耐受性试验1.2.3.1酸耐受性试验将芽孢率为超过90%的菌液，按照2%转接至pH值2.0、3.0、4.0及5.0的LB液体培养基，37 ℃振荡培养，1、2、3 h后进行活菌计数，计算存活率，设3个平行。1.2.3.2盐度耐受性试验将芽孢率为90%以上的菌液，按照2%转接至1%、2%、3%盐度的LB液体培养基，37 ℃振荡培养4 h进行活菌计数，计算存活率，设3个平行。1.2.3.3高温耐受性试验将芽孢率超过90%的菌液，在80、85、90 ℃分别处理10 min，活菌计数，计算存活率，设3个平行。1.3安全性试验试验鲫鱼经7 d驯化后，选择健康鲫鱼80尾，随机分4组，每组20尾鱼。1组为对照组，注射0.1 mL生理盐水；2~4组为试验组，分别注射0.1 mL浓度为1×109、1×108和1×107 CFU/mL的YJ4菌悬液，采用腹腔注射方法。23 ℃水温条件下饲养7 d，观察并记录试验鱼游动、摄食及死亡情况，最后剖检，观察有无病变。2结果与分析2.1抑菌性能菌株的初筛结果（见图1）以嗜水气单胞菌为指示菌，从鲫鱼肠道内容物中通过点种法分离得到96株细菌，其中17株对嗜水气单胞菌有抑菌效果，通过菌落特征、镜检菌体特征对比，得到9株性状不同的抑菌菌株。图1抑菌性能菌株的初筛结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.016.F1a1（a）点种法初筛抑菌性能菌株（1-24）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.016.F1a2（b）点种法初筛抑菌性能菌株（25-72）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.016.F1a3（c）点种法初筛抑菌性能菌株（73-96）2.2抑菌性能菌株的复筛（见表1、图2）哈维氏弧菌(BLCC8-0094)、溶藻弧菌(BLCC8-0109)、副溶血弧菌(BLCC8-0111)、维氏气单胞菌(BLCC8-0097)为指示菌，以打孔法检测9株抑菌菌株对指示菌的抑菌性能。由表1、图2可知，菌株YJ4对BLCC8-0109抑菌效果最佳，其次是BLCC8-0083、BLCC8-0097，对BLCC8-0111、BLCC8-0094略差，但也优于其他筛选菌株。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.016.T001表1YJ4对水产病原菌抑制试验菌株指示菌抑菌圈直径BLCC8-0083BLCC8-0111BLCC8-0109）BLCC8-0094BLCC8-0097YJ410.60±0.188.89±0.1214.09±0.087.25±0.0710.15±0.06YJ218.12±0.129.42±0.095.37±0.054.23±0.097.27±0.07YJ327.34±0.026.38±0.094.26±0.104.64±0.117.01±0.06YJ677.81±0.020.00±0.000.00±0.005.33±0.088.22±0.05YJ728.36±0.197.04±0.085.26±0.135.35±0.087.95±0.09YJ8010.49±0.110.00±0.000.00±0.000.00±0.0010.22±0.06YJ899.55±0.109.61±0.126.55±0.135.16±0.119.12±0.06YJ918.67±0.108.89±0.135.85±0.114.68±0.060.00±0.00YJ9510.24±0.129.98±0.126.29±0.145.96±0.0810.30±0.04mm图2YJ4对水产病原菌抑制试验结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.016.F2a110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.016.F2a210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.016.F2a32.3筛选菌株的鉴定2.3.1菌株形态观察（见图3、图4）由图3可知，菌株YJ4，菌落呈圆形，灰白色，不透明，边缘整齐，表面干燥无光泽。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.016.F003图3YJ4枯草芽孢杆菌菌落形态由图4可知，革兰氏染色呈阳性，在显微镜下观察菌体呈杆状，两端钝圆，芽孢中生，椭圆。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.016.F004图4革兰氏染色菌体形态2.3.2菌株生理生化试验（见表2）由表2可知，菌株YJ4在V-P试验、甲基红、接触酶、淀粉水解、明胶液化试验中均呈阳性；能够水解明胶和淀粉。以阿拉伯糖、木糖和甘露醇代替葡萄糖可产酸；可以利用柠檬酸盐，不利用丙酸盐。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.016.T002表2菌株YJ4的生理生化特征反应接触酶酪素水解酪氨酸水解淀粉水解柠檬酸盐丙酸盐阿拉伯糖产酸葡萄糖产酸木糖产酸甘露醇产酸明胶液化硝酸盐还原甲基红V-P7%NaCl结果++-++-+++++++++注：“+”表示生化反应阳性；“-”表示生化反应阴性。在7% NaCl中可以生长。菌株YJ4能够水解酪素，不分解酪氨酸。根据《伯杰细菌鉴定手册》初步鉴定为枯草芽孢杆菌。2.3.316SrDNA序列测定及系统发育学分析（见图5）由图5可知，将菌株YJ4测序结果在NCBI中进行Blast比对，菌株YJ4与Bacillus subtilis NJ1（登录号：KT588643.1）的序列相似性为99%。通过MEGA6.0软件构建系统进化树，结果显示，菌株YJ4与枯草芽孢杆菌亲缘关系最近，聚类为一支。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.016.F005图516S rDNA序列的菌株YJ4系统发育树2.4菌株耐受性分析2.4.1YJ4酸耐受试验（见表3）由表3可知，菌株YJ4在pH值为2.0~5.0范围内，存活率基本不受影响。pH值3.0条件下，3 h菌种的存活率为72.7%，pH值2.0的条件下，3 h存活率为67.2%。结果表明，菌株YJ4由于其芽孢的保护作用可以耐受胃肠道的酸性环境，顺利通过胃酸进入肠道，进而发挥益生菌的作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.016.T003表3酸度对YJ4菌株活菌数的影响时间/hpH值2.0pH值3.0pH值4.0pH值5.0活菌数/(108 CFU/mL)存活率/%活菌数/(108 CFU/mL)存活率/%活菌数/(108 CFU/mL)存活率/%活菌数/(108 CFU/mL)存活率/%08.800±0.058100.08.800±0.058100.08.800±0.058100.08.800±0.058100.017.154±0.06781.37.550±0.05885.88.166±0.13392.88.483±0.10096.426.653±0.03375.66.978±0.08879.37.858±0.03389.38.254±0.08893.835.914±0.06767.26.398±0.08872.77.330±0.08883.38.078±0.06791.82.4.2YJ4盐度耐受试验（见表4）由表4可知，菌株在盐度为1%~3%范围内存活率基本不受影响，能够耐受3%的盐度环境。在盐度3%的条件下4 h菌株存活率可达90.1%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.016.T004表4盐度对YJ4菌株存活率的影响时间/h盐度1%盐度2%盐度3%活菌数/(108 CFU/mL)存活率/%活菌数/(108 CFU/mL)存活率/%活菌数/(108 CFU/mL)存活率/%09.800±0.058100.09.800±0.058100.09.800±0.058100.049.433±0.06796.39.167±0.08893.58.833±0.08890.12.4.3YJ4热耐受试验（见表5）由表5可知，YJ4经80 ℃热处理10 min存活率为91.4%，85 ℃热处理10 min后存活率为87.9%，90 ℃热处理10 min存活率为80.8%。表明YJ4在生长后期形成芽孢，可耐受高温。YJ4芽孢良好的耐热性，能够在饲料加工过程中耐受高温膨化制粒过程便于添加和混合至水产饲料。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.016.T005表5热处理对YJ4菌株存活率的影响时间/min80 ℃85 ℃90 ℃活菌数/(108 CFU/mL)存活率/%活菌数/(108 CFU/mL)存活率/%活菌数/(108 CFU/mL)存活率/%09.367±0.088100.09.367±0.088100.09.367±0.088100.0108.567±0.14591.48.233±0.14587.97.567±0.14580.82.5YJ4安全性试验注射YJ4菌悬液后，观察7 d。与对照组相比，鲫鱼健康有活力，均未出现发病症状及死亡情况，剖检肝、脾、肠等脏器均正常无病变。表明枯草芽孢杆菌YJ4安全，无毒副作用。3讨论试验从鲫鱼肠道中分离筛选1株具有抑菌活性的菌株YJ4，与枯草芽孢杆菌的同源性最高达99%，初步鉴定为枯草芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌是可以直接饲喂的有益微生态制剂。研究表明，芽孢杆菌能够产生细菌素、肽类、酶类、抗菌蛋白类、大环内酯类、脂肽类和聚酮类化合物等多种抗菌活性物质[8-12]。对病原菌具有明显的抑制作用、占位作用，对营养、氧气的竞争作用，从而对病原菌产生明显的生物拮抗作用[13-15]。任雨薇[16]在草鱼的肠道内筛选出一株对嗜水气单胞菌等水产病原菌具有拮抗作用的枯草芽孢杆菌-Ch9。王文君[17]从对虾养殖池塘分离筛选出一株对病原菌具有拮抗作用的枯草芽孢杆菌-BLl，对溶藻弧菌、创伤弧菌及副溶血弧菌具有明显颉颃作用。鲁瑞娟[7]从洛阳南陈鱼塘分离获得1株对水产常见病原菌河流弧菌、嗜水气单胞菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌等6种菌具有良好抑菌效果的枯草芽孢杆菌。樊丹等[18]从健康虹鳟幼鱼肠道中分离到1株枯草芽孢杆菌RT-BS07具有良好抑菌性能，对温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌、鲁氏耶尔森氏菌等几种致病菌具有抑制效果。本试验筛选所得抑菌性能菌株YJ4，其发酵液对嗜水气单胞菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、维氏气单胞菌均具有较强抑菌作用。本试验结果与上述报道类似，可以为今后水产养殖益生菌的分离筛选提供抑菌性能的参考。实际应用中，益生菌发挥生物学作用要考虑动物胃酸的强降解作用、养殖水体盐度耐受性能及饲料制备过程中的高温等，筛选能够耐酸、耐盐、耐高温效果好的菌株尤为重要。孙承文等[19]从健康养殖鱼虾塘水体中分离出8株芽孢杆菌，通过耐酸、耐高温试验，抑菌试验以及安全性试验研究分离菌株的生物学功能。本试验结果表明，8株芽孢杆菌分别在pH值为3.0、4.0、5.0条件下处理2 h，存活率均在86%以上；在80 ℃条件下处理15 min，存活率为80%~90%，90 ℃以上存活率下降较快，说明8株芽孢杆菌均具有较强的耐酸、耐高温特性。资英娟等[20]从污水中分离到一株可高效降解化学耗氧量(COD)的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）H2，耐受性试验发现，该菌具有较强的盐度代谢能力和温度及酸碱度胁迫耐受性，可以适应不同的温度和盐度环境。刘晓燕等[21]从南美白对虾养殖池底泥中筛选了一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）WH1，体外生物特性研究表明，菌株WH1比模式菌具有更强的耐高温、耐人工胃液、耐胆盐、抑制金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌能力。本结果表明，当pH值为2~5时，菌株存活率大于67％；盐度为1％~3％时，菌株存活率大于90％；温度为80~90 ℃时，菌株存活率大于80％。本试验结果表明，枯草芽孢杆菌YJ4具有耐酸、耐盐、耐高温的特点。耐受性能强，适用于水产饲料添加制备，可作为水产微生态制剂使用。4结论本试验从健康鲫鱼肠道内容物中分离得到1株对多种水产病原菌具有良好抑菌性能的枯草芽孢杆菌YJ4，该菌株对酸、盐度、高温均具有较好的耐受性能，安全无毒害，适用于水产养殖及饲料添加，可作为水产益生菌进行深入研究。