白藜芦醇（RES）是一种天然、高活性的多酚类化合物，具有预防心血管疾病[1]、抗癌[2]、抗氧化、抗菌消炎[3]和抗突变[4]等保健作用。绿色、环保和可持续养殖是未来发展的趋势，因此开发具备多种生物活性的新型功能性饲料添加剂在动物养殖中具有广阔的应用前景。白藜芦醇在缓解畜禽动物热应激[5]、调控脂代谢[6]和改善肉制品[7-8]等方面均有不同程度效果，能够保护动物胃肠道健康[9]，提高动物氧化应激能力[10]、饲料转化率，改善畜禽产品品质[11]。我国葡萄酒、葡萄浓缩汁和葡萄饮品等行业年消耗葡萄量巨大，以20%~30%废渣产生率计算[12]，葡萄皮渣年产量高达数百万吨。研究发现，葡萄皮中RES含量较高[13]。因此，葡萄皮作为一种更廉价的RES提取原料逐渐引起关注。目前，关于RES的提取方法已有很多，包括有机溶剂提取法、碱溶酸沉淀提取法、超临界提取法、超声波提取法和酶解提取法等[14-16]。不同方法在提取时长、提取效率和提取成本等方面表现各不相同，但不同提取方法间的对比研究较少。因此，本试验拟以葡萄皮渣为研究对象，采用正交分析法，研究两种不同RES提取方法（酶解提取法和超声波提取法）各自最优的提取条件，比较最优条件下两种方法对RES提取效果的影响，以期为葡萄皮渣中提取RES方法提供参考。1材料与方法1.1试验材料葡萄皮渣为湖南神州庄园葡萄酒业有限公司回收的巨峰葡萄皮渣。将葡萄皮渣简单清除杂质，60 ℃恒温烘干48 h至恒重，粉碎，过60目筛，脱脂处理，-18 ℃分装密封保存。RES标准品（Solarbio公司，纯度≥98%）、纤维素酶（Sigma-Aldrich公司，酶活性≥50 000 U/g）；其余化学试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。API5500超高效液相色谱串联质谱仪（Applied Biosystems公司）、XS 105十万分之一分析天平（Mettler公司）、RE-2000E旋转蒸发仪（郑州长征仪器）、CR21N高速冷冻离心机（Beckman Coulter公司）、超纯水机（实验室自制）。1.2测定指标及方法1.2.1RES含量RES含量检测方法参照《NY/T 2641—2014 植物源性食品中RES和白藜芦醇苷的测定——高效液相色谱法》，RES以质量分数w（μg/g）表示，计算3次，取平均值。w=ρ×Vm (1)式中：ρ为待测液体中RES的质量浓度（mg/L）；V为定容体积（mL）；m为试样质量（g）。1.2.2标准曲线绘制制作RES质量分数浓度为：1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和12.0 mg/L标准品，以体积分数95%的乙醇作为溶剂，50 mL容量瓶定容。根据上述标准，所有标准品于306 nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。1.2.3单因素试验设计酶解提取法的试验初始处理条件为：称取1.1中粉碎过滤后的葡萄皮渣样品5 g，加100 mL超纯水，调pH值至5，添加2.0%纤维素酶，45 ℃酶解120 min，乙醇与葡萄皮渣的液料比为25 mL/g。依据上述基本条件，采用单因素轮换法依次改变：①纤维素酶添加量：1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%；②酶解时间：30、60、90、120和150 min；③酶解温度：35、40、45、50和55 ℃。利用方差分析，考察3个因素在酶解提取法中对葡萄皮渣中RES含量的影响。超声波提取法的试验初始处理条件为：称取1.1中粉碎过滤后的葡萄皮渣样品5 g，加入100 mL超纯水，乙醇与葡萄皮渣的液料比为25 mL/g，超声波功率为200 W，超声波处理30 min，于50 ℃中提取2 h。依据上述基本条件，采用单因素轮换法依次改变：①超声波功率：100、150、200、250和300 W；②超声波处理时间：10、20、30、40和50 min；③提取温度：20、30、40、50和60 ℃。利用方差分析，考察3个因素在超声波提取法中对葡萄皮渣中RES含量的影响。1.2.4正交试验设计在上述1.2.3单因素试验基础上，筛选各因素最佳范围后，分别对酶解提取法和超声波提取法设计3因素3水平的L9（34）正交试验[17]。酶解提取法提取葡萄皮渣中RES正交试验设计见表1，超声波提取法提取葡萄皮渣中RES正交试验设计见表2，确定两种提取方法在葡萄皮渣中提取RES的最优工艺条件。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.017.T001表1酶解提取法提取葡萄皮渣中RES正交试验设计水平纤维素酶添加量/%酶解时间/min酶解温度/℃11.5604022.0904532.51205010.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.017.T002表2超声波提取法提取葡萄皮渣中RES正交试验设计水平超声波功率/W超声波处理时间/min提取温度/℃1200304022504050330050601.2.5比较不同提取方法对葡萄皮渣中RES含量影响根据正交分析结果，选择酶解提取法和超声波提取法中各自最优的工艺组合，比较最优工艺下，两种方法提取葡萄皮渣中RES效果的差异。1.3数据统计与分析试验数据采用Microsoft Excel 2016进行汇总和整理，采用SPSS 27.0软件进行方差分析，采用GLM模型对标准曲线进行拟合，采用极差分析对正交试验结果进行分析，对2种提取方法（酶解提取法和超声波提取法）中最优工艺的结果进行T检验分析。2结果与分析2.1RES样品标准曲线及回归方程（见图1）将1.2.2中的结果进行回归分析，以RES质量浓度为x轴、吸光度为y轴绘制标准曲线。图中黑色三角形为标准品实际测定值，蓝色虚线为拟合曲线。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.017.F001图1RES样品标准曲线及回归方程2.2酶解提取法单因素试验结果2.2.1纤维素酶对葡萄皮渣中RES含量的影响（见图2）由图2可知，酶解提取法中，当纤维素酶添加量为2.0%时，葡萄皮渣中RES含量达到最大（928.46 μg/g），随后趋于平缓。添加2.5%、3.0%纤维素酶的RES含量与添加2.0%纤维素酶差异较小。后续正交试验中将纤维素酶添加量设为1.5%、2.0%和2.5%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.017.F002图2纤维素酶对葡萄皮渣中RES含量的影响2.2.2酶解时间对葡萄皮渣中RES含量的影响（见图3）由图3可知，酶解时间在90 min时葡萄皮渣中RES含量达到880.78 μg/g；酶解时间延长至120和150 min时，RES含量略有上升，但与90 min组相比相差不大。因此选择酶解时间为60、90和120 min用于后续正交试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.017.F003图3酶解时间对葡萄皮渣中RES含量的影响2.2.3酶解温度对葡萄皮渣中RES含量的影响（见图4）由图4可知，酶解温度上升到45 ℃时，葡萄皮渣中RES含量最高，为862.33 μg/g。45 ℃组与40 ℃组的RES含量相差较大，与55 ℃组相比差异较小。因此选择酶解温度为40、45和50 ℃进行后续正交试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.017.F004图4酶解温度对葡萄皮渣中RES含量的影响2.3超声波提取法单因素试验结果2.3.1超声波功率对葡萄皮渣中RES含量的影响（见图5）由图5可知，超声波功率在250 W时，葡萄皮渣中RES含量最高，为795.88 μg/g。超声功率为250、200 W的RES含量与300 W差异不大。因此后续正交试验中，超声波功率设为200、250和300 W。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.017.F005图5超声波功率对葡萄皮渣中RES含量的影响2.3.2超声波处理时间对葡萄皮渣中RES含量影响（见图6）由图6可知，超声波处理时间在30 min时，葡萄皮渣中RES含量达到较高值，为706.22 μg/g。当处理时间延长至40 min时，与30 min组相比葡萄皮渣中RES含量无明显提高；但当时间继续延长至50 min后，与30 min组相比则提高较多。因此后续正交试验中，超声波功率设为30、40和50 min。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.017.F006图6超声波处理时间对葡萄皮渣中RES含量的影响2.3.3提取温度对葡萄皮渣中RES含量影响（见图7）由图7可知，在超声波提取法中，提取温度对葡萄皮渣中RES含量的影响呈先高后低的趋势。提取温度在50 ℃时，葡萄皮渣中RES含量达到最高为804.89 μg/g。因此后续正交试验中，提取温度设为40、50和60 ℃。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.017.F007图7提取温度对葡萄皮渣中RES含量的影响2.4正交试验结果2.4.1酶解提取法正交试验结果（见表3、表4）由表3可知，酶解提取法中影响葡萄皮渣中RES含量的3个因素，根据R值得出影响因素重要性依次为：酶解温度纤维素酶添加量酶解时间。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.017.T003表3L9（34）正交试验与极差分析结果项目纤维素酶添加量酶解时间酶解温度RES含量/(μg/g)1111780.992122881.173133864.404213870.325221794.086232926.747312938.888323877.559331816.25K12 526.562 590.192 391.32K22 591.142 552.802 612.28K32 632.682 607.392 746.78k1842.19863.40797.11k2863.71850.93870.76k3877.56869.13915.59R35.3718.20118.48由表4可知，在单因素分析最佳范围内，酶解温度对葡萄皮渣中RES含量有极显著影响（P0.01）；纤维素酶添加量和酶解时间均对RES含量无显著影响（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.017.T004表4酶解提取法多因素方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值截距6 674 265.5716 674 265.5790 265.800.000**纤维素酶添加量1 906.402953.2012.890.070酶解时间519.322259.663.510.220酶解温度21 474.83210 737.41145.220.007**误差147.88273.94注：1.R²=0.994 0。2.“*”表示影响显著（P0.05），“**”表示影响极显著（P0.01）；下表同。综合极差分析和方差分析结果，取各项因素k值最大为最优参数，则酶解法提取葡萄皮渣中RES的最优工艺参数为：纤维素酶添加量2.5%、酶解时间120 min和酶解温度50 ℃。2.4.2超声波提取法正交试验结果（见表5、表6）由表5可知，超声波提取法中影响葡萄皮渣中RES含量的3个因素，根据R值得出影响因素重要性依次为：超声波处理时间超声波功率提取温度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.017.T005表5超声波提取法正交试验与极差分析结果项目超声波功率超声波处理时间提取温度RES含量/(μg/g)1111509.122123714.433132842.594213539.735222801.206231849.067312664.768321801.409333882.98K12 066.151 713.622 159.58K22 189.992 317.042 308.56K32 349.142 574.632 137.14k1688.72571.21719.86k2730.00772.35769.52k3783.05858.21712.38R94.33287.0057.14由表6可知，在单因素分析最佳范围内，超声波处理时间对葡萄皮渣中RES含量有极显著影响（P0.01）；超声波功率对RES含量存在显著影响（P0.05）；提取温度对RES含量无显著影响（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.017.T006表6超声波提取法多因素方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值截距4 847 732.4214 847 732.4226 472.660.000**超声波功率13 417.3926 708.7036.640.027*超声波处理时间130 203.21265 101.61355.510.003**提取温度5 786.3322 893.1715.800.060误差366.242183.12注：R ²=0.998 0。综合极差分析和方差分析结果，取各项因素k值最大为最优参数，则超声波法提取葡萄皮渣中RES的最优工艺参数为：超声波功率300 W、超声波处理时间50 min和提取温度50 ℃。2.5不同提取方法对葡萄皮渣中RES含量影响（见表7、图8）由表7、表8可知，同在最优工艺条件下，酶解法和超声波法，RES平均提取量分别为964.15和896.74 μg/g。T检验结果显示，酶解提取法提取葡萄皮渣中RES得到的含量显著高于超声波提取法（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.017.T007表7最佳发酵参数条件下葡萄皮渣中RES含量项目123456平均值酶解提取法974.35947.67970.45921.13984.46986.88964.15超声波提取法907.24888.35894.62872.99896.13921.10896.74μg/g10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.017.F008图8不同提取方法对葡萄皮渣中RES含量的影响3讨论RES多以白藜芦醇苷和白藜芦醇多聚衍生体形式存在于植物中，如葡萄皮渣。因此，通过酶类转化可将上述物质转化为RES，大大提高RES提取率[18-19]。本试验通过正交试验发现，酶解提取法中影响葡萄皮渣中RES含量的3个因素大小依次为：酶解温度纤维素酶添加量酶解时间，与王彦平等[16]研究结果一致，且酶解温度对葡萄皮渣中RES含量具有极显著影响。说明酶解过程中，温度对酶活性的影响远大于其他因素，酶活性则直接影响生产效率。因此，在酶解过程中寻找合适的酶解温度是酶解提取法应用的关键。酶品种的选择也可能是一个重要方面。王彦平等[16]在葡萄皮渣中添加由2.5%纤维素酶和1.2%果胶酶制成的复合酶，结果发现，在酶解温度45 ℃，酶解时间100 min条件下，赤霞珠郎酒葡萄皮渣RES的平均含量为（927±4.11）μg/g。瞿卫林等[20]利用虎杖药材自身酶进行自然酵解，结果显示，与传统方法相比，此方法能够使虎杖中RES含量提高2.72倍。利用酶解法植物中RES时，酶类的选择较为丰富，且可以对不同酶类组合进行更深入研究。超声波提取法是通过对高速、剧烈的空化效应，从物理层面破坏植物细胞壁结构，使RES等有效成分得以释放，从而提高提取效率[21]。本研究表明，超声波提取法中影响葡萄皮渣中RES含量的3个因素大小依次为：超声波处理时间超声波功率提取温度，与汪开拓等[22]研究结果类似。多因素方差分析表明，超声波处理时间和超声波功率分别对葡萄皮渣中RES含量具有极显著和显著影响。但总体超声波提取法获得的RES含量显著低于酶解提取法，可能由于超声波提取法仅从物理水平释放植物细胞内的RES，但酶解提取法从生化水平可进一步将RES苷等转化为RES，提高RES含量[23]。4结论本研究表明，利用酶解提取法提取葡萄皮渣中RES的最优工艺参数为：纤维素酶添加量2.5%、酶解时间120 min和酶解温度55 ℃；利用超声波提取法的最优工艺参数为：超声波功率300 W、超声波处理时间50 min和提取温度40 ℃。酶解提取法比超声波提取法能够更显著的提高葡萄皮渣中RES的提取量。本试验认为优化后的酶解提取法能够更好地从葡萄皮渣中提取RES，从而提高RES产量。