发酵饲料是以饲料原料为底物，经一种或多种益生菌如乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌等发酵制作而成的，是绿色、高效、安全的生物饲料[1-2]。益生菌发酵过程中，大分子被降解成小分子的氨基酸和小肽，能够促进畜禽对营养物质的消化吸收。益生菌进入肠道后可以调节肠道微生物平衡，抑制大肠杆菌及沙门氏菌浓度，增强机体免疫力[3]。发酵饲料还能够提高畜禽生产性能，改善饲料品质，增加饲料适口性，提高采食量[4]。研究表明，家禽饲粮中添加发酵饲料是有益的。Pramestya等[5]在100%蛋鸭商品饲料中添加1%的发酵桑叶粉，结果发现，发酵桑叶粉能够增加饲料消耗，增加蛋重。魏炳栋等[6]在肉鸡饲粮中添加5%和10%的发酵玉米蛋白粉均能够显著降低料重比，提高肉仔鸡生长性能，调节肠道菌群结构，提高血清中抗氧化酶活性。Feng等[7]发现，在饲粮中添加5%发酵麦麸部分替代玉米，能够提高肉鸡十二指肠消化酶活性和肠道菌群丰度。Kang等[8]在海兰褐产蛋鸡饲粮中添加10 g/kg的乳酸菌发酵沙棘，蛋鸡的日产蛋量及蛋重显著提高，肠道乳酸菌浓度提高，大肠杆菌浓度降低。Semjon等[9]在17周龄罗曼-布朗蛋鸡饲粮中添加固态发酵饲料，蛋鸡的蛋壳硬度及蛋黄抗氧化活性显著提高。本试验在产蛋后期蛋鸡基础饲粮中添加乳酸菌发酵饲料，探究其对蛋鸡产蛋率、肠道功能、养分排泄量及血清生化指标的影响。1材料与方法1.1试验地点试验在句容市浩源生态农业科技有限公司进行。1.2发酵饲料的制备发酵饲料以乳酸菌为主要发酵菌种，以玉米、豆粕、米糠等为主要饲料原料。将菌粉以1∶40溶于温水，混匀，稀释，加入发酵基质中搅拌均匀，37 ℃恒温发酵48 h。发酵饲料总菌落数≥1×109 CFU，pH值≤5.0，水分≤42%。1.3试验设计选取同一鸡舍体重相近的580日龄海兰褐商品蛋鸡960只，随机分成4组，每组8个重复，每个重复30只。A组为对照组蛋鸡饲喂基础饲粮；B组、C组、D组为试验组，分别在基础饲粮里添加2%、2.5%、3%的发酵饲料。基础饲粮组成及营养水平见表1。预试期7 d，正式试验期42 d。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.008.T001表1基础饲粮组成及营养水平原料组成含量/%营养水平合计100.0玉米62.3代谢能/(MJ/kg)11.29豆粕24.0粗蛋白/%16.31豆油0.7钙/%3.40石粉8.0总磷/%0.55预混料5.0蛋氨酸/%0.48赖氨酸/%1.02蛋氨酸+半胱氨酸/%0.65注：1.每千克预混料为饲粮提供：VA≥195 000 IU、VD3≥75 000 IU、VE≥500 IU、VK3≥60 mg、VB1≥44 mg、VB2≥135 mg、VB6≥75 mg、VB12≥0.44 mg、烟酰胺≥880 mg、泛酸≥330 mg、叶酸≥30 mg、D-生物素≥6.6 mg、Zn≥1 700 mg、Fe≥1 600 mg、Mn≥2 400 mg、Cu≥250 mg、I≥22 mg、Se≥6.0 mg、NaCl 3%~15%、Ca≥2.5%、总磷≥2.5%、氯化胆碱≥6 500 mg。2.营养水平均为计算值。1.4饲养管理所有试验均在同一鸡舍进行，鸡舍统一为A型3层鸡笼，试验鸡群在第二层两侧笼内饲养，每笼3只。每日光照时间16 h，光照强度5 Lux，光照颜色为红色[10]。试验鸡于每日7：00和18：00进行饲喂，自由采食、饮水。固定饲养人员，保证鸡舍安静、卫生，防止鸡群应激。保证饮水清洁。1.5测定指标及方法1.5.1样品采集每天统计产蛋数，计算产蛋率。正式试验期最后1 d，每个重复随机选1只鸡采血，用于测定血清生化指标。采血后对鸡进行屠宰，取肠道食糜用于测定肠道消化酶活性，取十二指肠和空肠中间段用于制作石蜡切片。取鸡粪用于测定其中的养分含量。1.5.2肠道消化酶活性测定肠道消化酶活性测定方法见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.008.T002表2肠道消化酶活性测定方法种类测定方法α-淀粉酶测定原理：α-淀粉酶能够水解淀粉生成葡萄糖、麦芽糖及糊精，在底物浓度已知且过量的情况下，加入碘液与未水解的淀粉结合生成蓝色复合物，根据蓝色深浅推算水解淀粉量，计算AMS活力酶活力单位：组织中每毫克蛋白在37 ℃与底物作用30 min，水解10 mg淀粉定义为1个淀粉酶活力单位测定方法：参照C016-1-1淀粉酶试剂盒（南京建成生物工程研究所）方法进行测定胰蛋白酶测定原理：胰蛋白酶能催化水解底物精氨酸乙酯的酯链，使其在253 nm处吸光度值升高，根据吸光度变化可以计算酶活力脂肪酶活力单位：在pH值为8.0，37 ℃条件下，每毫克蛋白中含有的胰蛋白酶每分钟使吸光度变化0.003即为1个酶活力单位测定方法：参照A080-2胰蛋白酶试剂盒（南京建成生物工程研究所）提供方法进行测定糜蛋白酶测定原理：以酪蛋白为底物，糜蛋白酶可水解蛋白产生含酚的氨基酸，酚试剂可以被含酚的氨基酸还原成蓝色物质，通过比色法测定糜蛋白酶活力酶活力单位：每毫克组织蛋白37 ℃每分钟分解蛋白生成1 μg氨基酸相当于1个酶活力单位。（1个酶活力单位=1 μg酪氨酸/min/mg组织蛋白）测定方法：参照A080-3糜蛋白酶试剂盒（南京建成生物工程研究所）提供的方法进行测定1.5.3十二指肠、空肠组织切片的制作、H.E染色与显微镜观察在十二指肠近端5 cm处和空肠中段约1 cm[11]各取5 mm，使用4%的甲醛溶液固定,定期更换，保持清澈。使用浓度由低到高（70%~100%）的乙醇溶液脱水，二甲苯透明。制作石蜡切片，采用H.E染色。显微镜下观察并测量绒毛长度（VL）、隐窝深度（CD）及肠壁厚度(WT)，计算绒毛长度与隐窝深度比值(V/C)。1.5.4养分排泄量正式试验期结束后，每个重复取50 g鸡粪，进行干粪中粗脂肪（EE）、粗蛋白（CP）、钙（Ca）及磷（P）含量的测定。EE含量选用FOSS全自动索氏抽提系统Soxtec 2050测定；CP含量选用FOSS Kjeltec8400全自动凯氏定氮仪测定；Ca含量测定选用C004-2-1钙（Ca）测试盒微板法测定（南京建成生物科技公司）；P含量测定选用C006-1-1磷（P）测试盒比色法（磷钼酸法）测定（南京建成生物科技公司）。1.5.5血清生化指标每个重复随机取1只鸡进行翅下静脉采血，置于预凝血管中保存，4 ℃、3 500 r/min离心10 min，血清-20 ℃保存。使用日立7160生化分析仪测定血清钙（Ca）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）含量以及谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）活性。1.6数据统计与分析试验数据用Excel 2019整理，采用SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析，结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1发酵饲料对蛋鸡产蛋率的影响（见表3）由表3可知，C组蛋鸡的产蛋率显著高于A组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.008.T003表3发酵饲料对蛋鸡产蛋率的影响组别产蛋率A组70.20±5.43bB组71.61±1.76abC组73.32±2.82aD组71.59±2.16ab注：同列数据肩标不同字母者表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。%2.2发酵饲料对蛋鸡肠道消化酶活性的影响（见表4）由表4可知，B组、C组、D组蛋鸡十二指肠和空肠淀粉酶活性显著高于A组（P0.05）；B组、C组、D组蛋鸡回肠α-淀粉酶活性均高于A组（P0.05）；C组蛋鸡盲肠α-淀粉酶活性高于其他组（P0.05）。各组间十二指肠胰蛋白酶活性差异不显著（P0.05）；B组、C组、D组蛋鸡空肠胰蛋白酶活性均显著高于A组（P0.05）；C组蛋鸡回肠胰蛋白酶活性显著高于其他组（P0.05）；C组、D组蛋鸡盲肠胰蛋白酶活性显著高于A组（P0.05）。试验组蛋鸡十二指肠糜蛋白酶活性均小于A组（P0.05）；C组、D组蛋鸡空肠和盲肠糜蛋白酶活性显著高于A组、B组（P0.05）；各组间回肠糜蛋白酶性差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.008.T004表4发酵饲料对蛋鸡小肠消化酶活性的影响项目组别十二指肠空肠回肠盲肠α-淀粉酶/(U/mg prot)A组0.04±0.01b0.08±0.02b0.11±0.030.09±0.04B组0.07±0.02a0.13±0.04a0.11±0.030.09±0.04C组0.08±0.03a0.16±0.06a0.13±0.050.10±0.01D组0.07±0.02a0.18±0.05a0.15±0.050.08±0.02胰蛋白酶/(U/mg prot)A组2 017.14±1 084.723 278.01±808.64b2 639.28±739.00b1 038.40±467.38bB组1 769.06±594.774 148.26±1 419.01a1 981.31±790.86b1 144.86±250.70bC组2 206.47±678.514 382.70±1 220.42a3 767.40±676.30a1 736.96±722.74aD组1 762.48±928.974 942.08±1 052.43a2 653.28±778.18b1 946.15±482.37a糜蛋白酶/(U/μg prot)A组5.86±3.252.49±1.14b0.61±0.300.18±0.08bB组3.57±1.221.54±0.92b0.51±0.250.19±0.06bC组3.69±2.223.23±1.25a0.65±0.390.27±0.11aD组3.60±1.794.49±1.31a0.63±0.320.26±0.11a2.3发酵饲料对蛋鸡肠道组织形态的影响（见表5）由表5可知，试验组蛋鸡十二指肠VL均高于A组，C组蛋鸡的十二指肠VL显著高于A组（P0.05）；试验组蛋鸡十二指肠CD均小于A组（P0.05）；试验组蛋鸡的V/C均高于A组（P0.05）；试验组蛋鸡十二指肠WT均高于A组（P0.05）。各组间蛋鸡空肠的VL、CD、V/C及WT均差异不显著（P0.05），但试验组蛋鸡空肠的V/C及WT值均比A组高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.008.T005表5发酵饲料对蛋鸡肠道组织形态的影响组织组别VL/μmCD/μmV/CWT/μm十二指肠A组943.91±27.93b242.29±11.973.90±0.15197.37±26.04B组1 021.35±94.07ab226.10±15.444.52±0.49200.41±21.64C组1 093.84±68.46a237.06±23.354.61±0.72203.33±34.52D组1 025.96±67.19ab238.65±22.104.30±0.42219.08±22.38空肠A组947.34±57.79234.96±33.994.12±0.63175.87±11.01B组1 005.95±80.69203.66±10.554.95±0.40176.07±22.94C组940.64±28.09214.66±23.734.52±0.55184.60±30.11D组997.97±44.28242.30±30.204.18±0.55191.58±30.592.4发酵饲料对蛋鸡养分排泄量的影响（见表6）由表6可知，C组和D组蛋鸡鸡粪的EE和Ca含量显著低于A组（P0.05）；试验组蛋鸡鸡粪P含量显著低于A组（P0.05）；B组、C组蛋鸡鸡粪CP含量显著低于A组（P0.05）。因此，饲粮中添加发酵饲料可改善蛋鸡的养分利用率（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.008.T006表6发酵饲料对蛋鸡养分排泄量的影响组别EECaPCPA组10.53±1.27a20.50±1.22a10.11±3.20a30.67±3.16aB组11.49±0.96a20.06±1.99a7.45±1.03b25.22±2.87bC组7.27±0.93b15.41±4.13b7.68±1.90b26.88±2.04bD组7.52±0.73b16.38±1.58b6.34±2.37b28.21±2.16ab%2.5饲粮添加发酵饲料对蛋鸡血清生化指标的影响（见表7）由表7可知，C组蛋鸡血清Ca浓度显著高于A组（P0.05）；试验组蛋鸡血清中TP、ALB、GLB浓度均高于A组（P0.05）；各组蛋鸡血清中AST、ALT活性、AST/ALT以及A/G值均差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.008.T007表7发酵饲料对蛋鸡血清生化指标的影响项目A组B组C组D组Ca/(mmol/L)3.99±0.14b4.08±0.11ab4.27±0.16a4.24±0.19bALT/(U/L)11.67±2.2210.22±2.4812.27±3.3614.19±3.51AST/(U/L)190.11±18.63190.86±24.57191.19±30.13189.94±36.74AST/ALT16.67±2.3519.79±5.2816.68±4.7714.21±4.20TP/(g/L)53.86±6.9961.95±13.9656.83±6.6262.68±7.15ALB/(g/L)16.66±1.3117.06±1.7517.79±1.2917.93±1.07GLB/(g/L)37.26±5.8044.89±11.8339.04±5.6444.76±6.28A/G0.45±0.040.40±0.070.46±0.050.41±0.04注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。3讨论3.1发酵饲料对蛋鸡肠道功能的影响蛋鸡在产蛋后期比产蛋高峰期生产性能下降与肠道功能受损有关[12]，包括肠道消化吸收能力下降、免疫能力降低、肠道屏障损伤及微生态失衡[13]等。小肠消化酶活性是影响肠道消化吸收能力的重要因素之一。发酵饲料中乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌等微生物在发酵饲料中起主要作用，微生物发酵过程中能够产生淀粉酶、蛋白酶及脂肪酶等，能够促进单胃动物消化不能直接利用的抗营养因子，如植酸、α-半乳糖苷、非淀粉多糖（NSP）、单宁、环丙烯脂肪酸等[14]，促进肠道对营养物质的吸收。本试验中，添加2.5%和3.0%的发酵饲料能够显著提高小肠α-淀粉酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶活性。因此，饲粮中添加发酵饲料能够有效提高小肠消化酶活性。Sun等[15]研究发现，在黄羽肉鸡饲粮中添加发酵棉籽粕（FCSM）能够显著提高21日龄的淀粉酶和蛋白酶活性以及42日龄时的蛋白酶活性。Zhang等[16]在老龄蛋鸡饲粮中添加酵母菌发酵培养物，结果发现，蛋鸡十二指肠食糜中糜蛋白酶和α-淀粉酶活性提高54.8%~62.5%。肠道绒毛长度、隐窝深度是衡量小肠吸收能力的重要指标，能够直接反映肠道功能及肠道健康[17]。肠道绒毛长度变长，增大绒毛表面的吸收面积，增加对营养物质的消化吸收利用效率[18]。肠上皮细胞在隐窝分泌，是肠黏膜屏障的主要结构成分，能够提供一种物理和生化屏障，隔开宿主组织和共生菌，维持肠道自身稳定[19]。肠上皮细胞在隐窝分化后，向绒毛顶部迁移，使隐窝变浅，表明肠上皮细胞的生成率提高[20]。本试验中，蛋鸡饲粮添加2.5%的发酵饲料能够增加十二指肠VL以及十二指肠和空肠V/C值。Xu等[21]研究表明，饲粮中添加10%发酵菜粕（RSM）可以显著提高肉鸡十二指肠和空肠VL。饲喂10%发酵丹参能够极显著增大空肠V/C。Zhang等[22]研究发现，在峨眉乌鸡饲粮中添加6%的发酵饲料能够明显增加空肠VL。Naji等[23]研究发现，在罗斯肉鸡饲粮中添加20%、50%、75%和100%的发酵饲料均能够增加十二指肠、空肠和回肠的VL以及V/C。Misstton等[24]给1日龄的罗斯肉鸡饲喂发酵湿饲料，发现第39 d空肠中段和回肠中段VC分别为提高22.6%和16.0%。3.2发酵饲料对蛋鸡养分排泄量的影响本试验中，添加2.5%和3.0%的发酵饲料使EE排泄量与对照组相比分别降低30.9%和28.6%，使Ca排泄量分别降低24.8%和20.1%；添加2.0%的发酵饲料使CP排泄量与对照组相比降低17.7%；不同水平的发酵饲料使P的排泄量分别降低26.3%、24.0%和37.3%。因此，添加发酵饲料可显著提高饲料养分利用率。原因可能是发酵饲料中的乳酸菌等有益菌能够促进蛋白酶和脂肪酶的合成[25]，有助于肠道对CP和EE的消化吸收；乳酸菌、酵母菌和丁酸梭菌等能产生乳酸、乙酸、丁酸等有机酸以及乙醇，降低肠道pH值[26]。适宜的酸性环境可以维持肠道正常的生理功能，提高消化酶活性，有助于机体对养分的吸收[27-30]。Ashayerizadeh等[31]给雄性Cobb肉鸡分别饲喂发酵菜籽粕（FRM）和生菜粕（RRM），结果发现，添加FRM组回肠中GE、CP和EE的表观消化率显著高于RRM组。Li等[32]在岭南黄羽肉鸡饲粮中添加10%的益生菌发酵饲料，结果发现，肉鸡的DM、CP以及总能（GE）的全肠道表观消化率显著提高。3.3饲粮添加发酵饲料对蛋鸡血清生化指标的影响血清生化指标体现机体的营养吸收以及生理状况，是新陈代谢变化的反映[33]，对各种疾病具有诊断价值。血钙浓度能够影响蛋壳质量，决定蛋壳脆性。本试验中，C组蛋鸡血清Ca浓度比A组显著提高7.02%。彭箫等[34]在54周龄京红蛋鸡饲粮中添加30 g/kg的发酵饲料，蛋鸡血清Ca2+含量升高11.99%，与本试验结果相似；原因可能是肠道酸性环境促进对Ca的吸收，使血清Ca浓度升高。本试验中，各组间AST、ALT活性以及AST/ALT均差异不显著，表明在本试验中发酵饲料对蛋鸡肝功能无明显影响。TP和ALB指标反映机体对蛋白质的消化吸收与代谢水平[35]，试验组TP和ALB浓度在数值上均有所增加，表明发酵饲料有助于机体合成与利用蛋白质。丁小青等[36]研究发现，在仙居鸡饲粮中添加以茶渣、豆粕和麸皮为底物，浓度为6%的发酵饲料可以显著提高血清中ALB浓度。Panda等[37]给日本鹌鹑饲喂10%或15%的发酵鱼青贮（FFS），均可显著提高血清ALB。GLB是衡量机体体液免疫的重要指标，IgA、IgG和IgM是免疫系统的重要组成部分，而IgG对家禽尤为重要。本试验中，试验组GLB浓度均有所增加，表明发酵饲料对机体免疫功能具有一定的促进作用，可能是乳酸菌发酵时提高IgG和IgA浓度，促进GLB合成[38]；也可能是发酵饲料中的益生菌调节肠道菌群，组织外界病原微生物的入侵，增强机体免疫力。Ding等[39]采用植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌发酵芝麻粕（FSM）替代豆粕饲喂肉鸭，结果发现，添加6%的FSM可以显著提高血清免疫球蛋白IgA浓度。因此，发酵饲料对蛋鸡血清生化指标有一定影响。4结论在580日龄海兰褐蛋鸡饲粮中添加2.5%的发酵饲料可以较好地提高产蛋率，改善肠道功能，提高饲料养分利用率。