β-葡聚糖和甘露聚糖是提取自酿酒酵母细胞壁的复合型酵母多糖。酵母细胞壁对动物体具有良好的免疫调节功能，能够改善动物的肠道环境，促进动物体生长[1-4]，具有无毒副作用、绿色环保等优点，可以作为替抗产品在畜禽养殖业应用[5]。细胞壁多糖是酵母细胞壁的一部分，不同含量细胞壁多糖对动物体的影响不同[6-10]。因此，必须检出酵母细胞壁中多糖的准确含量。高效液相色谱法是目前常用的细胞壁多糖的检测方法[11-14]，但高效液相色谱法具有步骤烦琐、耗时长的缺点。近红外是介于可见光与中红外光之间的电磁波，波长范围为780~2 526 nm。近红外光谱法可以在1 min内无损且快速检出酵母细胞壁中β-葡聚糖和甘露聚糖的含量。近红外光谱法通过利用化合物C—H键、O—H键、S—H键、N—H键的倍频转动或振动以及合频的转动或振动以漫反射或透射的方式获得样品在近红外区域的吸收光谱，通过人工神经网络[15]（ANN）、偏最小二乘法[16]（PLSR）、主成分回归法[17]（PCR）等现代化学计量学方法进行检测。β-葡聚糖和甘露聚糖的近红外光谱主要为C—H键和O—H键的倍频与合频信息，使用高效液相色谱法测得酵母细胞壁中二者的含量后，将酵母细胞壁多糖检测值结合近红外光谱，通过PLSR算法建立β-葡聚糖和甘露聚糖快测模型，并根据拟合优度（R-Square），校正均方根误差（RMSEC）以及预测均方根误差（RMSEP），判断出该模型具有良好的预测效果，可用于酵母细胞壁中活性成分含量的快速检测。1材料与方法1.1试验材料1.1.1细胞壁普通型CE酵母细胞壁由安琪酵母股份有限公司提供；加强型CE酵母细胞壁由安琪酵母（伊犁）有限公司提供；活化型CE细胞壁、非活化型CE细胞壁由安琪酵母（柳州）有限公司提供。1.1.2主要试剂37%盐酸（分析纯，西陇科学股份有限公司）、氢氧化钠（分析纯，西陇科学股份有限公司）；无水葡萄糖（标准品，Sigma公司，纯度99.5%）、D-甘露糖（标准品，Sigma公司，纯度99%）；25 mL具塞玻璃管（天津市天玻玻璃仪器有限公司）、250 mL耐高温带盖玻璃水解瓶（天津市天玻玻璃仪器有限公司）、100、200 mL容量瓶（天津市天玻玻璃仪器有限公司）；0.45 μm乙酸纤维素膜（Pall公司）1.2主要仪器YXQ-LS-50A立式灭菌锅（上海博讯实业有限公司）；Milli-Q去离子水发生器（Millipore公司）；LS120A电子天平（上海天美天平仪器有限公司）、E2695 HPLC高效液相色谱仪（Wtaers公司），色谱柱为Aminex HPX-87H ion Exclusion（7.8 mm×300 mm BIO-RAD 1）。FT9700傅里叶近红外变换光谱仪（Perkin Elmer公司）。光源种类为卤钨灯光源。样品杯由蓝宝石制成，主要成分为三氧化二铝。分束器为宽范围多镀层CaF2。分辨率：1 ~64 cm-1可调。噪声：15 uAbs（1 min，RMS）。光谱范围：700~2 600 nm（14 300~3 800 cm-1）。漫反射采样附件：电磁驱动旋转样品盘，保证光谱数据均一性。1.3样品测量方法选取安琪酵母公司产的细胞壁1 320份，原产地为柳州、宜昌、伊犁，且细胞壁包含多种菌类，工艺有所差别。每份样品精确称取0.4 g（称准至0.002 g），将样品放入至25 mL具塞玻璃管中，加入6.0 mL盐酸（37%），拧紧瓶盖，使用旋涡混合器振荡均匀。将具塞玻璃管放至30 ℃水浴45 min，其中每隔15 min使用旋涡混合器振荡混匀一次。水浴完成将管内试液转移至250 mL水解瓶，100~120 mL一级水多次洗涤具塞玻璃管，每次洗涤完成将洗涤液并入水解瓶中。随后将水解瓶放入灭菌锅，121 ℃处理1 h，锅内温度冷却至100 ℃取出，水浴冷却至室温，使用40 g/L氢氧化溶液调节pH值至6~7，转移至200 mL容量瓶，加水定容至刻度，使用0.45 μm孔径的乙酸纤维素膜过滤。标准曲线的制备：将少量无水甘露糖和无水葡萄糖转移至称量瓶，98~100 ℃干燥30 min，在干燥器中冷却至室温。准确称取上述干燥后的葡萄糖和甘露糖各0.200 0 g至烧杯中，以少量一级水溶解，转移至100 mL容量瓶中，使用高纯水定容、摇匀，每次检测前现配现用，浓度分别为0、200、400、600、800、1 000 mg/L。细胞壁加入盐酸充分水解后，试液中基本只含单糖，使用带示差检测器的高效液相色谱仪测出的峰为甘露糖和葡萄糖的峰，通过换算即可求出细胞壁中β-葡聚糖和甘露聚糖的含量。ω=A1×0.2×100m1×1 000×0.9×F (1)F=P×(100-W)A2×0.2×100m2×1 000×0.9 (2)式中：ω为试样中β-葡聚糖或甘露聚糖含量（%）；A1为根据试样溶液的峰面积在标准曲线计算得到的试样溶液的葡萄糖或甘露糖的含量（mg/L）；A2为根据葡聚糖对照品溶液的峰面积在标准曲线上查得的样品溶液的葡萄糖的含量（mg/L）；m1为称取试样的质量（g）；m2为称取葡聚糖对照品的质量（g）；0.2为试样处理后的定容体积（L）；0.9为将甘露糖或葡萄糖换算成甘露聚糖或β-葡聚糖的系数；F为样品酸水解中葡萄糖或甘露糖被破坏造成结果偏低的经验补偿系数；W为葡聚糖对照品的水分（源于试剂厂家所提供的检测报告）；P为葡聚糖对照品的纯度（源于试剂厂家所提供的检测报告）。1.4光谱采集使用可旋转的固体样品杯，保证光谱的均一性。将酵母细胞壁倒入至样品杯内，超过杯体积1/2，抖动，防止底部有缝隙。酵母细胞壁共1 407批，将其中1 387批作为校正集，20批作为预测集，建模时剔除异常值后，β-葡聚糖参数的校正集共含1 336批，甘露聚糖参数的校正集共含1 294批，β-葡聚糖的含量范围在20%~40%之间，甘露聚糖的含量范围在18%~31%之间，校正集的β-葡聚糖和甘露聚糖的含量范围可完全覆盖预测集的β-葡聚糖和甘露聚糖的含量范围，仪器分辨率为16 cm-1。2结果与分析2.1模型的建立β-葡聚糖和甘露聚糖分别建立两条不同的曲线，建模软件为The Unscrambler X 10.4 (64-bit)，数据处理软件为Excel 2016版本。酵母细胞壁近红外原始图谱见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.021.F001图1酵母细胞壁近红外原始图谱由图1可知，近红外光谱图不仅包含酵母细胞壁中β-葡聚糖和甘露聚糖的吸收信息，还包含部分与酵母细胞壁活性成分无关的干扰信息，如仪器本身的影响、光散射以及样品不均匀等引起的噪声信息，均会导致近红外光谱基线产生漂移、倾斜等现象。因此，挑选合适的波段、采用合理的光谱预处理方法能够有效增强模型的稳健性，提高预测能力。由于光谱的首段14 304~10 608 cm-1及末段3 992~3 856 cm-1光谱无有用信息且噪声较大，预处理光谱前将其剔除，仅采用10 600~4 000 cm-1波段进行光谱预处理。光谱预处理采用平滑滤波法（S-G），并对光谱进行一阶求导或者二阶求导，有效提高光谱的平滑性，多元散射校正（MSC）、标准正态变量转化（SNV）均可用于校正样品散射所引起的光谱误差，去趋势算法（De-trending）可消除基线的漂移，4种方法通过结合的方式找出最低校正均方根误差RMSEC，最高拟合优度R-Square。不同光谱预处理方法所建检测酵母细胞壁中β-葡聚糖含量模型与甘露聚糖含量模型的结果见表1、表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.021.T001表1不同光谱预处理方法所建检测酵母细胞壁中β-葡聚糖含量模型的结果编号预处理方法主因子数RMSEC/%R-Square1S-G、1st、平滑系数：7、SNV、De-trending131.160.902S-G、1st、平滑系数：7、MSC、De-trending131.160.903S-G、2st、平滑系数：7、SNV、De-trending81.280.884S-G、2st、平滑系数：7、MSC、De-trending81.280.8810.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.021.T002表2不同光谱预处理方法所建检测酵母细胞壁中甘露聚糖含量模型的结果编号预处理方法主因子数RMSEC/%R-Square1S-G、1st、7（平滑系数）、SNV、De-trending130.990.712S-G、1st、7（平滑系数）、MSC、De-trending130.990.713S-G、2st、7（平滑系数）、SNV、De-trending101.040.684S-G、2st、7（平滑系数）、MSC、De-trending101.040.68由表1、表2可知，使用MSC和SNV对光谱进行预处理，效果基本相同；一阶求导和二阶求导对光谱进行预处理略有差别，二阶求导的RMSEC值偏大，R-Square偏小，但其模型的主因子数小于一阶求导模型的主因子数。考虑到样品量偏大，主因子数的增加可能会出现过拟合的状况，即包含过多杂余信息。现选取表1中“1、3”光谱预处理方法以及表2中“1、3”光谱预处理方法，除求导不同外，其他光谱预处理方法一致。将20个预测集代入其中，比较其RMSEP值。β-葡聚糖与甘露聚糖不同算法模型的预测能力见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.021.T003表3β-葡聚糖与甘露聚糖不同算法模型的预测能力名称校正均方根误差/%校正集线性相关系数(R2)预测均方根误差/%预测集相关系数（R2）β-葡聚糖（S-G、1st、7、SNV、De-trending）1.160.901.120.90β-葡聚糖（S-G、2st、7、SNV、De-trending）1.280.881.170.90甘露聚糖（S-G、1st、7、SNV、De-trending）0.990.711.110.75甘露聚糖（S-G、2st、7、 SNV、De-trending）1.040.681.090.65由表3可知，β-葡聚糖在建模时光谱预处理方法选择S-G、平滑系数：7、一阶求导、SNV、De-trending时，RMSEC值和RMESP值最小，R-Square值最大，模型拟合效果最好。由图2、图3可知，甘露聚糖在建模时光谱预处理选择S-G、平滑系数：7、一阶求导、SNV、De-trending时，RMSEC值最小和RMESP值相对较小，R-Square值最大，模型拟合效果较好。β-葡聚糖在建模时光谱预处理方法选择 S-G、平滑系数：7、一阶求导、SNV、De-trending时，RMSEC值和RMESP值最小，R-Square值最大，模型拟合效果最好图2β-葡聚糖和甘露聚糖不同算法模型校正集线性关系10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.021.F2a1（a）β-葡聚糖、S-G、1st校正关系10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.021.F2a2（b）β-葡聚糖、S-G、2st校正关系β-葡聚糖和甘露聚糖不同算法模型校正与验证集线性关系见图2、图3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.021.F2a3（c）甘露聚糖、S-G、1st校正关系10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.021.F2a4（d）甘露聚糖、S-G、2st校正关系图3β-葡聚糖和甘露聚糖不同算法模型验证集线性关系10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.021.F3a1（a）β-葡聚糖、S-G、1st验证关系10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.021.F3a2（b）β-葡聚糖、S-G、2st验证关系10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.021.F3a3（c）甘露聚糖、S-G、1st验证关系10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.021.F3a4（d）甘露聚糖、S-G、2st验证关系2.2β-葡聚糖模型的精密度检验结果（见表4）由表4可知，20个酵母细胞壁预测集β-葡聚糖含量实际值的均值为29.04%，预测值的均值也为29.04%，极差值为3.06%，预测集的最大相对误差为9.35%，考虑到盐酸消解细胞壁的过程中可能反应不完全，导致手工数据存在一定的误差，相对误差在10%以内的数据都可接受，该结果可以证明酵母细胞壁β-葡聚糖预测模型具有良好的精密度和准确度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.021.T004表4β-葡聚糖模型精密度检验预测集实际值预测值残差相对误差均值29.0429.04——T132.3732.59-0.220.68T234.1035.82-1.724.93T334.6034.410.190.56T434.3031.243.069.35T531.2832.01-0.732.31T634.8433.801.043.02T728.4327.520.913.24T833.3432.460.882.68T927.0027.69-0.692.54T1024.1025.62-1.526.11T1126.4027.66-1.264.66T1226.5026.240.260.98T1328.0027.960.040.14T1428.3028.35-0.050.17T1523.6022.091.516.59T1628.0028.26-0.260.94T1728.3028.81-0.511.80T1825.8027.18-1.385.22T1925.3025.40-0.100.41T2026.2025.610.592.29%2.3甘露聚糖模型的精密度检验结果（见表5）由表5可知，20个酵母细胞壁预测集甘露聚糖含量实际值的均值为26.48%，预测值的均值为27.10%，极差值为3.01%，预测集的最大相对误差为12.27%。考虑盐酸消解细胞壁的过程中可能反应不完全，导致手工数据存在一定的误差，相对误差在10%左右的数据均可接受，20个预测值中出现了一个异常值，可通过设置马氏距离阈值报警剔除异常值，该结果可证明酵母细胞壁甘露聚糖预测模型具有较好的精密度和准确度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.021.T005表5甘露聚糖模型精密度检验预测集实际值预测值残差相对误差均值26.4827.10——G123.0626.07-3.0112.27G221.4323.75-2.3210.26G326.0226.05-0.030.13G427.7227.84-0.120.42G528.8427.930.913.22G625.7927.77-1.987.38G724.2124.64-0.431.75G825.6026.42-0.823.15G927.2026.520.682.53G1027.0027.22-0.220.80G1126.8026.89-0.090.32G1228.1028.090.010.05G1327.4027.89-0.491.76G1427.2027.69-0.491.78G1526.6028.00-1.405.12G1627.4028.10-0.702.53G1727.7028.25-0.551.98G1827.8028.03-0.230.81G1926.8027.45-0.652.40G2026.9027.33-0.431.59%3结论利用近红外光谱结合化学计量学方法，建立酵母细胞壁中活性成分β-葡聚糖和甘露聚糖定量检测模型，使用该模型可在1 min内无损且快速检测出酵母细胞壁中β-葡聚糖和甘露聚糖的含量。光谱预处理采用平滑滤波法（S-G），对光谱进行一阶求导，结合标准正态变量转化（SNV）以及去趋势算法（De-trending），可以有效提高光谱的平滑性、消除噪声、基线漂移。处理完成后的图谱，通过偏最小二乘法结合手工预测值所建立的模型，具有良好的精密度和准确度。通过近红外光谱法检测酵母细胞壁中的活性物质β-葡聚糖和甘露聚糖有效解决传统方法高效液相色谱法步骤烦琐、耗时长、试剂消耗量大的缺点。