瘤胃中存在大量微生物，如细菌、真菌、原虫等。犊牛瘤胃内的微生物能够降解饲料中的蛋白质、淀粉等营养物质，为机体提高可消化吸收的小分子营养物质。瘤胃中的厌氧微生物可以分解饲料转化为氨态氮和挥发性脂肪酸，为机体提供生长所需的能量和蛋白质[1-2]。新生犊牛瘤胃尚未完全发育，瘤胃内的微生物结构受年龄、饲粮等因素影响，若此时额外给犊牛饲喂益生菌可以帮助建立瘤胃菌群，完善瘤胃功能[3-4]。研究发现，益生菌在幼龄动物中的使用效果优于大龄动物，幼龄动物饲喂益生菌后会在瘤胃内生成乙酸、丙酸，降低瘤胃pH值，有助于完善瘤胃功能[5]。新生犊牛饲喂地衣芽孢杆菌能够提高犊牛生长性能，改善犊牛体况指标，调节瘤胃微生物区系[6]。在代乳料中添加乳酸菌和酵母菌可以提高奶牛的生长性能，降低腹泻率[7]。本试验以荷斯坦犊牛为研究对象，探讨复合益生菌对其生长性能、免疫功能、肠道菌群及发病率的影响，为复合益生菌在犊牛养殖中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验添加剂试验所用复合益生菌包括乳酸片球菌和植物乳杆菌，购自某生物公司。乳酸片球菌和植物乳杆菌的比例为1∶1，活菌数1.5×1010 CFU/g。1.2试验设计试验选取5日龄、体重（45.06±2.06）kg的犊牛40头，随机分为4组，每组5个重复，每个重复2头犊牛。对照组犊牛饲喂基础日粮，试验1组、试验2组、试验3组每头犊牛每日灌服1、2、3 g复合益生菌。预试期7 d，正式试验期56 d。基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.003.T001表1基础日粮组成及营养水平原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米44.50产奶净能/(MJ/kg)8.17豆粕20.00粗蛋白/%19.05棉籽粕10.00干物质/%83.80麸皮20.00钙/%1.43石粉1.00磷/%0.72磷酸氢钙1.50食盐0.80小苏打1.20预混料1.00注：1.预混料购自甘肃大北农农牧科技有限责任公司。2.营养水平均为计算值。1.3饲养管理试验期间，荷斯坦犊牛饲养在犊牛岛中，每日饲喂３次牛奶（5：30、13：30、20：00）。1~15日龄，每次饲喂量为2.5 L；16~30日龄，每次饲喂量为3.0 L；31~45日龄，每次饲喂量为3.5 L；46~60日龄，每次饲喂量为2 L。试验荷斯坦犊牛自由采食基础日粮、自由饮水。试验组犊牛在采食基础日粮后，将复合益生菌溶解在温水中，给犊牛灌服。1.4测定指标及方法1.4.1生长性能正式试验的第1 d和最后1 d早晨称量试验荷斯坦犊牛空腹12 h的体重；每天准确记录各组荷斯坦犊牛的采食量，计算平均日增重和平均日采食量。平均日增重=(末重－初重)/试验天数(1)平均日采食量=总采食量/试验天数(2)1.4.2免疫指标试验结束当日，犊牛禁食12 h，每组选择5头犊牛颈静脉采血10 mL，3 500 r/min离心10 min，取上层血清，-20 ℃保存，用于测定荷斯坦犊牛血清中免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）以及促炎因子白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、抗炎因子白细胞介素-10（IL-10）含量。试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，按照试剂盒说明书进行检测。1.4.3肠道菌群试验结束前3 d，每日采集100 g粪便，用于检测粪便微生物含量，冷藏保存。粪便大肠杆菌数量的测定方法参考GB/T 18869—2019，沙门氏菌数量的测定方法参考GB/T 13091—2002，乳酸菌数量的测定方法参考GB/T 4789.35—2016。1.4.4发病率试验期间，每日观察各组犊牛的腹泻、气管肺炎发病情况。腹泻率=(腹泻头数×腹泻天数)/(总头数×试验天数)×100%(3)肺炎发病率=(肺炎头数×发病天数)/(总头数×试验天数)×100%(4)1.5数据统计与分析试验数据采用Excel软件进行统计整理，SPSS 24.0进行单因素方差分析，LSD法进行多重比较。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同剂量复合益生菌对犊牛生长性能的影响（见表2）由表2可知，荷斯坦犊牛饲喂复合益生菌后，试验末重有升高趋势（P0.05）。试验2组和试验3组荷斯坦犊牛的平均日增重均显著高于对照组（P0.05）；试验1组荷斯坦犊牛的平均日增重比对照组升高趋势（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.003.T002表2不同剂量复合益生菌对犊牛生长性能的影响项目初重/kg末重/kg平均日增重/[kg/(头·d)]平均日采食量/[kg/(头·d)]P值0.5370.0740.0480.164对照组45.18±0.2786.58±0.530.74±0.09b0.64±0.08试验1组45.80±0.3189.27±0.500.78±0.12ab0.67±0.09试验2组46.04±0.2992.65±0.630.83±0.14a0.71±0.10试验3组46.47±0.4392.95±0.840.83±0.14a0.72±0.11注：同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著（P0.01），不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2不同剂量复合益生菌对犊牛血清免疫指标的影响（见表3）由表3可知，试验2组和试验3组荷斯坦犊牛的IgA含量比对照组提高了14.46%、16.87%（P0.05），比试验1组提高了6.74%、8.99%（P0.05）。试验2组和试验3组荷斯坦犊牛血清中的IgG含量比对照组提高了20.38%、28.53%（P0.01）；试验2组和试验3组犊牛血清中的TNF-α含量分别比对照组降低了14.33%、16.93%（P0.05）。各组犊牛血清IgM、IL-6、IL-10含量差异均不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.003.T003表3不同剂量复合益生菌对犊牛血清免疫指标的影响项目IgA/(g/L)IgG/(g/L)IgM/(g/L)IL-6/(ng/L)IL-10/(ng/L)TNF-α/(ng/L)P值0.0380.0070.1630.1060.0970.018对照组0.83±0.06b6.87±0.57B2.52±0.24632.17±20.64216.75±10.68425.06±15.64a试验1组0.89±0.07b7.26±0.64AB2.74±0.29626.95±20.21225.76±12.74389.50±15.03ab试验2组0.95±0.10a8.27±0.75A2.85±0.35618.69±18.54230.65±13.64364.17±14.95b试验3组0.97±0.11a8.83±0.86A2.90±0.33610.57±17.46235.37±13.07353.09±13.17b2.3不同剂量复合益生菌对犊牛肠道菌群的影响（见表4）由表4可知，荷斯坦犊牛饲喂复合益生菌能够极显著改善肠道菌群结构。试验组犊牛的乳酸菌数量极显著高于对照组（P0.01）；大肠杆菌和沙门氏菌的数量极显著低于对照组（P0.01）。研究表明，复合益生菌能够提高犊牛粪便有益菌数量，降低有害菌数量，改善肠道健康。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.003.T004表4不同剂量复合益生菌对犊牛肠道菌群的影响项目大肠杆菌/(×105 CFU/g)沙门氏菌/(×104 CFU/g)乳酸菌/(×104 CFU/g)P值0.0000.0000.000对照组8.31±0.73A30.68±3.80A4.07±0.56C试验1组5.36±0.40B15.47±1.89B8.63±0.90B试验2组3.47±0.36C9.51±0.97C12.64±1.37A试验3组2.47±0.29C7.34±0.52C14.59±1.80A2.4不同剂量复合益生菌对犊牛发病率的影响（见表5）由表5可知，荷斯坦犊牛饲喂复合益生菌后，试验组犊牛的腹泻率分别比对照组降低30.31%、61.07%、69.09%（P0.01）；肺炎发病率降低34.64%、52.58%、63.92%（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.003.T005表5不同剂量复合益生菌对犊牛发病率的影响项目腹泻率肺炎发病率P值0.0020.005对照组6.73±0.70A4.85±0.55A试验1组4.69±0.52B3.17±0.35B试验2组2.62±0.31C2.30±0.31BC试验3组2.08±0.26C1.75±0.19C%3讨论3.1不同剂量复合益生菌对犊牛生长性能的影响新生犊牛处于快速生长发育、构建各器官的阶段，此阶段的环境、饲料组成、添加剂等因素均会直接影响犊牛的生长发育及成年后的生长。本试验中，荷斯坦犊牛饲喂由乳酸片球菌和植物乳杆菌组成的复合益生菌后对平均日采食量未产生显著性的影响；添加复合益生菌组的荷斯坦犊牛的试验末重分别比对照组提高了3.11%、7.01%、7.36%；添加2、3 g复合益生菌组的荷斯坦犊牛的平均日增重比对照组均提高了12.16%，表明给新生犊牛饲喂2~3 g复合益生菌可显著改善犊牛的体重。聂召龙等[8]研究发现，断奶犊牦牛饲喂1 g复合益生菌（活菌数为1.7×1010 CFU/g）可以提高平均日增重、总干物质采食量和苜蓿草采食量。何家俊等[9]研究表明，与对照组相比，饲粮中添加4、8 g/d的丁酸梭菌犊牛的平均日增重提高90、120 g。卢佳伟等[10]研究发现，使用枯草芽孢杆菌+地衣芽孢杆菌联合饲喂断奶山羊可以显著改善山羊的生长性能，效果优于单一益生菌。上述结论与本试验结果相似，在幼龄反刍动物养殖生产中使用益生菌均可改善生长性能。原因与益生菌改善幼龄动物的肠道健康、提高胃肠道消化酶活性，促进营养物质消化吸收有关。3.2不同剂量复合益生菌对犊牛免疫指标的影响血清中的免疫球蛋白及免疫因子是动物机体感染后具有抗感染的重要的细胞因子，血清中的免疫球蛋白及免疫因子具有抗病毒、抗菌等多种重要功能[11]。免疫细胞和因子在动物机体防御感染过程中起重要作用。本试验中，2、3 g复合益生菌组荷斯坦犊牛的IgA含量分别比对照组显著提高14.46%、16.87%，比试验1组显著提高6.74%、8.99%；2、3 g复合益生菌组荷斯坦犊牛血清中的免疫球蛋白G含量分别显著比对照组提高20.38%、28.53%；血清中的TNF-α含量分别比对照组降低14.33%、16.93%。张智慧等[12]研究发现，在种公牛日粮中添加50、80 g/(头·d)组复合益生菌可以显著提高碘甲状腺原氨酸、IgA和IL-2含量。何家俊等[9]研究发现，在犊牛日粮中添加8 g的丁酸梭菌可以显著提高血清中的IgG含量。廖海洪[13]研究发现，联合使用复合益生菌与板蓝根多糖可以显著改善仔猪的免疫功能。目前，复合益生菌在反刍动物生产中研究结果较少，作用机制尚不明确，但丁酸梭菌可以激活机体的免疫系统，提高黏膜免疫活性和动物机体的免疫功能[14-15]。3.3不同剂量复合益生菌对犊牛肠道菌群的影响动物肠道是重要的免疫及消化器官，肠道中大量微生物能够影响机体对营养物质的消化吸收及机体的免疫功能。在动物日粮中额外添加益生菌可调节肠道菌群结构，进而改善动物机体的健康状况[16]。动物胃肠道内对机体有益的微生物可促进机体对营养物质的消化吸收利用，有害微生物会抑制营养物质的消化吸收利用，甚至抑制动物的生产性能，严重时可能导致死亡[17]。本试验中，荷斯坦犊牛饲喂复合益生菌后，试验组荷斯坦犊牛粪便中乳酸菌数量极显著提高；大肠杆菌和沙门氏菌的数量极显著降低，说明复合益生菌可以调节荷斯坦犊牛肠道菌群结构，改善肠道健康。陈凤梅等[18]研究发现，复合微生态制剂联合低聚果糖可以调节犊牛肠道菌群结构，提高拟杆菌属相对丰度，降低梭状芽孢杆菌相对丰度，从而降低腹泻率。何家俊等[9]研究发现，使用丁酸梭菌可以降低犊牛肠道中的大肠杆菌及沙门氏菌的数量。在动物养殖生产中，可以通过添加益生菌调节动物肠道菌群结构，进而促进机体对饲粮中营养物质的消化吸收，降低腹泻率，改善机体生长发育状况。3.4不同剂量复合益生菌对犊牛发病率的影响犊牛在断奶前，随着饲养环境的适应及开口料的采食，导致犊牛在养殖过程产生一些疾病，此阶段是犊牛易发病时期，需要额外注意犊牛的养殖护理工作。本试验中，荷斯坦犊牛饲喂复合益生菌后，试验组犊牛的腹泻率分别比对照组极显著降低30.31%、61.07%、69.09%；肺炎发病率极显著降低34.64%、52.58%、63.92%。因此，犊牛饲喂复合益生菌可改善肠道健康，促进瘤胃发育，降低犊牛的腹泻率和肺炎发病率，增强机体抗病力。复合益生菌可调节犊牛肠道黏膜免疫[19-20]，与本研究中犊牛血液中的免疫球蛋白含量提高保持一致。4结论本试验结果表明，饲喂复合益生菌可以显著改善荷斯坦犊牛体重、机体免疫力，调节肠道菌群结构，降低发病率，建议添加复合益生菌较为适应的添加量为2 g。