猪链球菌病（swine Streptococcosis）是由多种不同菌群的链球菌感染引起的一类传染病的总称[1]，以败血症、淋巴脓肿、心内膜炎、多发性浆膜炎等为典型特征，也可引起人的化脓性脑膜炎、败血症、关节炎，主要表现为发热和毒血症状，导致器官衰竭而死亡，是一种人畜共患病。该病呈世界范围内分布，美国、俄罗斯、法国、印度、丹麦、荷兰、加拿大、澳大利亚、新西兰等国均有报道链球菌病的疫情[2-3]，国内在20世纪70至80年代后期发病严重，在许多地区呈地方性流行、大面积暴发。近些年，河北、江苏、浙江、四川均发生人感染猪链球菌病例[4-9]。世界动物卫生组织将该病列为B类疫病，我国将其列为二类疫病[10]。该病给养猪业造成巨大的经济损失，并对相关从业人员的生命安全构成严重威胁。猪链球菌（Streptococcous suis， S.suis）根据荚膜多糖抗原不同分为35个血清型，其中能引起人畜共患的致病性链球菌血清型主要为1、2、7、9型。在国内发病猪群中，以2型猪链球菌感染报道居多，对9型猪链球菌感染报道较少。本试验对新疆某规模化猪场病猪的淋巴结、肺脏病料分离株进行分子生物学鉴定，开展药敏试验以此选取针对流行菌株的敏感药物，为明确猪场猪链球菌的血清型、研制针对性疫苗及临床快速诊断等提供参考。1材料与方法1.1病料采集病料采自新疆某猪场临床发病猪只淋巴结、肺脏等脏器。1.2试验试剂胰蛋白大豆肉汤培养基（胰蛋白胨、大豆蛋白胨、氯化钠、pH值7.2）由美国BD公司生产；5%绵羊血液营养琼脂培养基按常规方法配制；Taq DNA聚合酶、电泳凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司；DNA Marker DL2000、PCR Mix、dNTP、Taq PCR Buffe购自TaKaRa公司；犊牛血清购自杭州四季青有限公司；链球菌生化鉴定试剂盒、药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司；革兰氏染色试剂盒购自索莱宝公司；其他试剂均为国产分析纯。1.3病原菌的分离纯化将病变肺脏、淋巴结组织用火焰灼烧表面做无菌处理后剪取内部组织，同时划线接种于含5%牛血清的胰蛋白大豆琼脂平皿与绵羊血液琼脂平皿中，37 ℃恒温培养24 h，挑取呈灰白色、湿润、边缘整齐的圆形单菌落进行革兰氏染色、镜检及纯化，选取形态特征较为统一的优势菌落进行增菌培养。1.4生化特性鉴定取分离纯化的细菌纯培养物接种于葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、七叶尿素、硫化氢、硝酸盐、蔗糖、精氨酸等细菌微量生化反应管中，37 ℃恒温培养24 h，生化反应根据链球菌生化编码鉴定手册（GYZ—12St）判定。1.516S rDNA序列测定及分析16S rDNA的扩增引物为通用引物1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，27F：5'-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3'。按常规方法提取菌株的基因组DNA作为模板进行PCR扩增，回收PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。使用DNAStar对测序推导得到的16S rDNA序列与GenBank已发表的国外参考菌株的16S rDNA序列进行同源性比较和遗传进化的分析，同时采用MegAlign和邻接法（neighbor-joining，NJ）构建系统发育树见表1。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.02.014.T001表1构建系统发育树参考菌株Tab.1Reference strains for constructing phylogenetic trees菌株GenBank登录号来源分离地区S. suis strain ATCC 43765NR_115737.1病猪加拿大S. suis strain S735NR_036918.1病猪荷兰S. plurextorum strain 1956-2NR_042649.1病猪西班牙S. pneumoniae HER1055AJ617796.1成人西班牙S. rubneri strain LMG 27207NR_109720.1成人德国S. australis strain AI-1NR_036936.1儿童澳大利亚S. agalactiae JCM 5671AB023574.1牛日本S. suis strain CSCDC 119-176NR_117504.1病猪美国S. iniae CGXDQ985468.1罗非鱼中国S. iniae SCCF5LAY762259.1青蛙中国S. suis strain SC-ssJF513982.1病猪中国S. sinensisi strain HKU4NR_028833.1成人中国S. gallinaceus strain CCUG 42692NR_025453.1鸡丹麦S. iniae ATCC 29178AF335572.1虹鳟鱼以色列1.6猪链球菌的PCR分型检测根据猪链球菌不同血清型荚膜多糖cps基因的特异性设计1、2、7、9型猪链球菌的分型引物，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物具体信息见表2。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.02.014.T002表2引物信息Tab.2Primer information引物用途基因引物序列（5'-3'）产物大小/bp鉴定1型猪链球菌cps1ICTGAGTATAATGCCGATATAG438CTTCTCTTTAATAACTTTTGC鉴定2型猪链球菌cps2JCAAACGCAAGGAATTACGGATTC675GAGTACTAAAGAATGAATATTG鉴定7型猪链球菌cps7HTGCCCTCGTGGAATACAGCTA540GATAACAGTCATACTTCTTACAC鉴定9型猪链球菌cps9HGATGGCTACATATAATGGAAG394ATCCGAAGTATCTGGGCTAC以提取的分离菌株基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系：PCR Mix 0.4 μL、10×Taq PCR Buffer 5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）8 μL、DNA模板1.5 μL、上下游引物各1 μL、加ddH2O至终体积50 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 50 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 5 min。取PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。1.7小鼠致病性试验将分离菌株接种于含5%牛血清的胰蛋白大豆肉汤培养基37 ℃过夜培养，腹腔注射法对健康昆明小鼠进行攻击，攻击剂量约为5×108 CFU/mL，对照组小鼠注射等量生理盐水，每组10只小鼠，观察14 d内小鼠的死亡情况。及时剖检死亡小鼠，无菌采集肝脏、肺脏等病变组织并镜检。1.8药敏试验采用标准K-B纸片扩散法，将培养16~18 h生长良好的100 μL分离株菌液均匀涂布于含5%牛血清的胰蛋白大豆琼脂平皿表面，37 ℃培养24 h后检测分离株对林可霉素、多西环素、青霉素钠、环丙沙星、头孢噻呋、氟苯尼考、替米考星、氧氟沙星、磺胺嘧啶钠、硫酸黏菌素、氨苄西林钠、四环素、庆大霉素、阿莫西林14种抗生素的敏感性。2结果与分析2.1分离菌株的形态特征（见图1）由图1可知，该分离菌株在绵羊血液平皿上培养24 h后生长良好，形成灰白色、半透明、边缘整齐、呈β溶血的光滑型菌落（图1a）；革兰氏染色后镜检可观察到革兰氏阳性、2个到10个不等长链短链排列的球菌（图1b）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.02.014.F001图1分离菌株的形态特征Fig.1Morphological characteristics of isolated strains（a）分离株菌落形态 （b）革兰氏染色菌体形态2.2分离菌生化试验结果（见表3）由表3可知，该分离株能够发酵葡萄糖、乳糖、蔗糖，精氨酸、七叶苷为阳性，甘梨醇、山梨醇、尿素、硫化氢、硝酸盐、V-P为阴性，符合猪链球菌的生化特性。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.02.014.T003表3分离菌生化试验结果Tab.3Biochemical test results of isolates项目结果项目结果葡萄糖＋尿素—乳糖＋硫化氢—甘露醇—硝酸盐—山梨醇—蔗糖＋V-P试验—精氨酸＋七叶苷＋溶血＋注 ：“＋”表示阳性；“—”表示阴性。2.316S rDNA序列同源性分析（见图2）由图2可知，新疆分离株XJS9与猪链球菌标准菌株ATCC 43765（GenBank登录号：NR_115737.1）同源性为100%。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.02.014.F002图2分离株XJS9 16S rDNA序列同源性分析Fig.2Homology analysis of 16S rDNA sequence of isolate XJS92.416S rDNA序列进化树（见图3）由图3可知，所比较的源于不同菌株可以分为4个明显的基因群，分离株与4株猪链球菌亲缘关系较近，属于同一个进化分支Ⅰ群。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.02.014.F003图3分离菌16S rDNA基因系统发育树Fig.3Phylogenetic tree of 16S rDNA gene of isolate2.5猪链球菌的分型鉴定（见图4）由图4可知，以猪链球菌的血清型特异性引物进行PCR扩增，结果猪链球菌1、2、7型均未扩增出目的条带，但是猪链球菌9型扩增出约390 bp大小的特异性条带，表明该分离株为9型猪链球菌。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.02.014.F004图4临床分离菌株9型PCR扩增结果Fig.4The results of PCR amplification of type 9 clinical isolates2.6小鼠致病性试验将分离菌株接种于含5%牛血清的胰蛋白大豆肉汤培养基37 ℃培养24 h，腹腔攻击小鼠24 h后，小鼠表现被毛凌乱、畏冷、食欲废绝、呼吸急促等症状，后期眼内出现大量黄白色分泌物。部分小鼠在接种2 d内出现死亡。及时剖检死亡小鼠，脾脏肿大充血、出血，肺脏组织呈现灰白色肿胀。将组织的肺脏、肝脏用生理盐水研磨稀释后革兰氏染色镜检结果显示与猪链球菌形态特征一致。对照组小鼠表现正常。2.7药物敏感性试验结果（见表4）由表4可知，该分离菌株对克林霉素、多西环素、青霉素、环丙沙星、头孢噻呋、氟苯尼考、替米考星、氧氟沙星、磺胺嘧啶钠、硫酸黏菌素、氨苄西林11种药物敏感，对四环素、庆大霉素、阿莫西林表现耐药。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.02.014.T004表4药物敏感性试验结果Tab.4Results of drug sensitivity test抗菌药物敏感性抗菌药物敏感性阿莫西林R青霉素R环丙沙星S氟苯尼考S克林霉素S硫酸黏菌素S多西环素S替米考星S庆大霉素R头孢噻呋S氧氟沙星S磺胺嘧啶钠S四环素R氨苄西林R注 ：“S”表示敏感，“R”表示耐药。3讨论猪链球菌病是一种世界性分布的人畜共患传染病[11]。近年来，随着养猪业的快速规模化发展，猪链球菌病已给猪养殖业带来巨大的经济损失。猪链球菌2型是主要的流行血清型。但近年来9型猪链球菌的流行呈上升趋势，在我国各省市均有不同程度的发生和流行[12-13]。目前，有关新疆地区9型猪链球菌的分子流行情况的资料很少。本试验结果显示，新疆地区分离株与猪链球菌标准菌株ATCC43765同源性为100%。16S rDNA的序列信息，如今已经广泛运用于菌种鉴定和系统发育学研究[14-15]。根据不同属细菌16S rDNA基因同源性为70%~90%，而同一种内不同株间基因同源性＞99%[16]，从分子水平确定该菌株为猪链球菌，且该株链球菌进化稳定，未发生明显变异。为进一步确定分离株的血清型，设计鉴别猪链球菌1、2、7、9型的特异性引物，结果分离株扩增出约390 bp的预期片段，确定为9型猪链球菌。药敏试验结果显示，该分离菌株对克林霉素、多西环素、青霉素、环丙沙星、头孢噻呋、氟苯尼考、替米考星、氧氟沙星、磺胺嘧啶钠、硫酸黏菌素、氨苄西林11种药物敏感，对四环素（四环素类）、庆大霉素（氨基糖苷类）、阿莫西林（β-内酰胺类）表现耐药。Marie等[17]的研究显示，1996~2000年分离的135株猪源和人源链球菌的药敏结果显示对β-内酰胺类抗生素敏感。张振江等[18]分离1株9型猪链球菌，检测出tetO（四环素类）、aph-（3）-lia（氨基糖苷类）、Sul Ⅲ（磺胺类）耐药基因，与该菌株的耐药谱基本一致。徐引弟等[19]的研究表明，35株2型猪链球菌河南分离株中对庆大霉素、四环素、链霉素的耐药情况严重。目前，猪链球菌病是养殖业发病率较高的疾病之一，猪体内猪链球菌的带菌率约为20%~40%，在条件适宜的情况下细菌会发生变异产生毒力，诱因为外界温度的变化、饲料的更换、猪群的数量变化、猪舍的清洁卫生等。发病后快速传播，因此加强对猪链球菌病的防治，是降低该类疾病发生和传播的关键途径之一。本研究药敏试验结果提示，加强对养猪场的病原的分离与耐药情况进行检测，确定有效的药物进行治疗，获得最佳治疗效果，快速有效的控制猪场病情，但是长时间大量使用抗生会造成猪场细菌耐药，因此加速疫苗研发是对抗细菌耐药的重要性举措。明确当地流行的荚膜血清型，可以为有效防止猪链球菌病提供新思路，也为猪链球菌疫苗的研发提供参考。4结论本研究从新疆某猪场病猪组织中分离1株疑似猪链球菌，通过细菌的分离鉴定、形态学观察、生化试验等试验分析，确定该分离株为9型猪链球菌，与猪链球菌标准菌株ATCC43765同源性为100%。该链球菌的分离鉴定为该猪场的猪链球菌病的防控提供了参考。