2020年我国以滤食性贝类为主的海水贝类养殖面积为1 197.41 hm2，产量1 498.71万t[1]。由于高密度集约化养殖盛行，近海规模化贝类养殖中时常发生饵料微藻匮乏现象[2]，微藻藻粉常作为应急饵料[3]。毕相东等[4]以螺旋藻粉和小球藻粉为主要原料制备缓释性海水贝类复合饲料应用于海湾扇贝养殖中，并取得了较好的促生长效果。但是能够规模化培养且实际投入应用的螺旋藻粉价格约4万元/t，大幅提高了贝类养殖成本[3]。因此，亟须寻找低成本、高营养价值的微藻藻粉替代品。自1990年起，我国江河湖库相继暴发蓝藻水华，优势种类微囊藻（Microcystis）与螺旋藻同属蓝藻门，且营养成分相当，但其含有的微囊藻毒素（microcystins，MCs）可在生物体内积累，对生物体生长造成一定影响[5-6]。目前，我国多采取机械打捞方式[7-8]，打捞后的水华蓝藻多数以焚烧发电等方式处理[9-10]，造成了生物质资源的浪费。如果能够将水华蓝藻脱毒处理并规模化应用于贝类养殖生产应急处置中，将对贝类养殖产业产生重要意义。硬壳蛤（Mercenaria mercenaria）是主要的经济滩涂双壳贝类之一，耐温、耐盐范围广，适应多种底质养殖，且生长速度快[11]。为探讨脱毒水华蓝藻粉在贝类养殖生产应急处置中替代微藻藻粉的可行性，本研究以螺旋藻粉和盐藻粉作为对照组，测定脱毒水华蓝藻粉MCs含量、营养成分及其对硬壳蛤幼贝生长、摄食、肠道微生物多样性及硬壳蛤机体MCs蓄积量的影响，以期为脱毒水华蓝藻粉替代微藻藻粉在贝类养殖生产应急处置中应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1藻粉水华蓝藻粉由无锡德林海环保科技股份有限公司提供；螺旋藻粉、盐藻粉购自内蒙古兰太实业股份有限公司。1.1.2脱毒水华蓝藻粉制备采用反复冻融结合冻干处理制备脱毒水华蓝藻粉。（1）反复冻融脱毒。将每g水华蓝藻粉与40 mL蒸馏水混合，持续搅拌3 min，-20 ℃、37 ℃交替反复冻融5次，10 000 r/min离心20 min，弃上清，将藻泥平铺于培养皿上（厚度约4 mm），-20 ℃预冷过夜。（2）冻干获取藻粉。将预冷的藻泥置于冷冻真空干燥机（Thermo MODULYO D-230）中，-50 ℃冷冻干燥12 h。冷冻干燥后取出块状藻泥研磨获得脱毒水华蓝藻粉。1.2试验设计及饲养管理硬壳蛤幼贝（Mercenaria mercenaria）由国家贝类产业技术体系天津综合实验站提供，在实验室暂养7 d，暂养期间不投喂饵料。控制水温在(22.0±0.5) ℃，连续充气，既保证溶氧量高于8 mg/L，使藻粉在水中悬浮均匀。选择270个健康、活力较好的硬壳蛤幼贝[壳长(15.17±2.34) mm，壳宽(7.63±1.46) mm，壳高(13.46±2.16) mm]，随机分为3组，分别投喂经300目筛网的脱毒水华蓝藻粉、螺旋藻粉和盐藻粉，每组3个水箱（0.25 m×0.20 m×0.16 m，海水体积为5 L，盐度为25‰），每个水箱内30个硬壳蛤幼贝。试验期30 d，每日10：00投喂前换水1次，换水量为100%。每日10：00、12：00、14：00和16：00各投喂1次，投喂量为0.01 g/L。1.3测定指标及方法1.3.1藻粉MCs含量脱毒水华蓝藻粉、螺旋藻粉和盐藻粉MCs提取方法参考文献[12]，使用安捷伦1260Infinity Ⅱ高效液相色谱仪进行MCs含量测定。1.3.2藻粉营养成分依据GB/T 6435—2014、GB/T 6432—2018、GB/T 6433—2006、GB/T 6434—2006、GB/T 6438—2007、GB/T 6436—2018和GB/T 6437—2018测定脱毒水华蓝藻粉、螺旋藻粉和盐藻粉水分、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、粗灰分、钙和总磷等营养成分。依据GB/T 18246—2019测定脱毒水华蓝藻粉、螺旋藻粉和盐藻粉18种氨基酸组成；按照GB/T 21514—2008分析脱毒水华蓝藻粉、螺旋藻粉和盐藻粉脂肪酸组成。1.3.3生长性能投喂30 d准确测量硬壳蛤幼贝壳长、壳宽和壳高，计算增长率（GR）。GR(%)=(Lt-L0)/L0×100%(1)式中：Lt为终末平均长度（mm），L0为初始平均长度（mm），t为饲养时间（d）。1.3.4摄食率试验第1、10、20和30 d，每次投喂0、2 h后各取水样1次，共持续8 h，取样8次。饵料浓度采用光密度法进行测定[13]，采用TU-1810型紫外分光光度计分别在680、560和630 nm测定脱毒水华蓝藻粉、螺旋藻粉和盐藻粉稀释液吸光度，绘制标准曲线。参考文献[14]公式计算摄食率（FR）。FR[mg/(ind·h)]=V×(c0-c0×S-ct)/(N×t)(2)式中：V为试验海水体积（L），N为试验硬壳蛤幼贝数目（ind），t为试验间隔时间（h），c0和ct分别为初始和t时水体饵料浓度（mg/L），S为饵料变化系数。1.3.5肠道微生物提取及测定投喂30 d后，无菌状态下解剖硬壳蛤幼贝，取出肠道，-80 ℃保存。每组取3个硬壳蛤幼贝，共9份样品。按照参考文献[15]方法对细菌16S rRNA基因V3-4区进行PCR扩增，送至诺禾致源生物信息科技有限公司进行测序。1.3.6硬壳蛤幼贝蓄积MCs量取硬壳蛤幼贝内脏团和闭壳肌经冷冻干燥，研磨为粉末，每0.5 g组织干粉使用10 m L甲醇（90%）提取MCs，MCs纯化及测定方法参照1.3.1。1.4数据统计与分析试验数据采用SPSS 23.0软件进行单因素方差分析（Oneway ANOVA），Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1水华蓝藻粉脱毒效果螺旋藻粉和盐藻粉均未检测出MCs。水华蓝藻粉脱毒处理前MCs含量为7.498 μg/g，反复冻融脱毒处理后MCs含量为3.378 μg/g，下降了54.95%。2.2脱毒水华蓝藻粉、螺旋藻粉和盐藻粉营养成分（见表1~表3）由表1可知，脱毒水华蓝藻粉粗蛋白含量低于螺旋藻但高于盐藻，粗纤维、粗灰分和钙含量均高于螺旋藻粉和盐藻粉，粗脂肪和总磷含量均少于螺旋藻粉和盐藻粉。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.011.T001表1脱毒水华蓝藻粉、螺旋藻粉和盐藻粉营养成分组别水分粗蛋白粗脂肪粗纤维粗灰分钙总磷脱毒水华蓝藻粉9.055.070.21.1016.50.9720.16螺旋藻粉8.265.070.50.369.50.5021.27盐藻粉7.625.297.40.3113.60.2540.19%由表2可知，3种藻粉中共检测出8种非必需氨基酸和9种必需氨基酸，脱毒水华蓝藻粉和螺旋藻粉氨基酸组成相似度较高。脱毒水华蓝藻粉TAA含量为45.29 g/100 g，螺旋藻粉为52.40 g/100 g，脱毒水华蓝藻粉EAA高达20.84 g/100 g，EAA中亮氨酸比例最高；组氨酸比例最低。脱毒水华蓝藻粉TAA和EAA均大幅高于盐藻粉。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.011.T002表2脱毒水华蓝藻粉、螺旋藻粉和盐藻粉氨基酸含量项目脱毒水华蓝藻粉螺旋藻粉盐藻粉项目脱毒水华蓝藻粉螺旋藻粉盐藻粉天门冬氨酸/(g/100 g)4.424.991.90异亮氨酸#/(g/100 g)3.043.421.01丝氨酸/(g/100 g)2.442.650.89亮氨酸#/(g/100 g)3.794.091.67谷氨酸/(g/100 g)5.466.962.27苯丙氨酸#/(g/100 g)2.262.661.62脯氨酸/(g/100 g)1.351.620.76赖氨酸#/(g/100 g)2.582.780.97甘氨酸/(g/100 g)4.725.772.36组氨酸#/(g/100 g)0.520.750.33丙氨酸/(g/100 g)4.074.431.14精氨酸#/(g/100 g)3.313.671.26胱氨酸/(g/100 g)0.180.180.12非必需氨基酸(NEAA)/(g/100 g)24.4528.6210.26酪氨酸/(g/100 g)1.812.020.82必需氨基酸(EAA)/(g/100 g)20.8423.789.33苏氨酸#/(g/100 g)2.432.660.96总氨基酸(TAA)/(g/100 g)45.2952.4019.86缬氨酸#/(g/100 g)2.382.570.99EAA/TAA46.0145.3846.98蛋氨酸#/(g/100 g)0.531.180.52EAA/NEAA85.2483.0990.94注：“#”表示必需氨基酸。由表3可知，3中微藻粉中共检测出11种脂肪酸。脱毒水华蓝藻粉单不饱和脂肪酸含量和多不饱和脂肪酸含量均低于螺旋藻粉和盐藻粉，特有脂肪酸是十四碳一烯酸和花生一烯酸，未检测到二十碳五烯酸（EPA）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.011.T003表3脱毒水华蓝藻粉、螺旋粉和盐藻粉脂肪酸含量项目脱毒水华蓝藻粉螺旋藻粉盐藻粉项目脱毒水华蓝藻粉螺旋藻粉盐藻粉豆蔻酸3.63.76.1γ-亚麻酸5.1100.01.9十四碳一烯酸2.600α-亚麻酸1.8076.1棕榈酸118.1230.0178.7花生一烯酸1.100棕榈一烯酸2.041.511.2二十碳五烯酸0.01.50硬脂酸8.14.37.8脂肪酸总量166.4489.5363.8油酸14.413.053.7总饱和脂肪酸（SFA）129.8238.0192.6亚油酸9.697.028.3总单不饱和脂肪酸（MUFA）20.154.564.9mg/100 g2.3脱毒水华蓝藻粉对硬壳蛤幼贝生长及摄食的影响（见表4、表5）脱毒水华蓝藻粉浓度（x）、螺旋藻粉浓度（x）和盐藻粉浓度（x）与吸光度值（y）的拟合方程分别为y=0.735 7x-0.000 2 (R2=0.991 6)、y=0.978 6x－0.000 6 (R2=0.990 0)、y=1.05x-0.000 7 (R2=0.993 1)。由表4可知，各组藻粉对硬壳蛤幼贝初始壳长、壳宽和壳高及其增长率均差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.011.T004表4脱毒水华蓝藻粉、螺旋藻粉和盐藻粉对硬壳蛤幼贝生长的影响组别壳长/mm增长率/%壳宽/mm增长率/%壳高/mm增长率/%脱水华蓝藻粉17.80±2.7817.31±17.748.93±1.5717.13±19.7415.39±2.4414.32±17.65螺旋藻粉17.50±3.0415.37±17.868.87±1.6916.31±19.5115.41±2.5914.48±17.47盐藻粉17.91±3.3118.04±17.688.96±1.8117.45±16.7315.77±2.8817.17±17.99由表5可知，第20 d，脱毒水华蓝藻粉组硬壳蛤幼贝摄食率显著高于螺旋藻粉组（P0.05）。除第1 d外，脱毒水华蓝藻粉组硬壳蛤幼贝摄食率均显著高于盐藻粉组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.011.T005表5投喂脱毒水华蓝藻粉对硬壳蛤幼贝摄食率的影响组别第1 d第10 d第20 d第30 d脱毒水华蓝藻粉0.456±0.1220.493±0.044a0.718±0.061a0.850±0.173a螺旋藻粉0.418±0.0890.468±0.028ab0.628±0.021b0.748±0.055ab盐藻粉0.407±0.0630.425±0.019b0.546±0.029b0.601±0.109b注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。mg/（ind·h）2.4脱毒水华蓝藻粉对硬壳蛤幼贝肠道结构的影响2.4.1对硬壳蛤幼贝肠道微生物α多样性的影响（见表6）由表6可知，脱毒水华蓝藻粉组硬壳蛤肠道微生物ACE指数、Chao1指数、Shannon指数和Simpson指数最高，但与其他两组间差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.011.T006表6投喂脱毒水华蓝藻粉对硬壳蛤幼贝肠道微生物α多样性指数的影响组别覆盖率/%OTUs数量ACE指数Chao1指数Shannon指数Simpson指数脱毒蓝藻粉99.8641690.40±17.41684.86±24.414.91±0.330.90±0.03螺旋藻粉99.8778829.31±180.63826.17±175.854.58±0.870.82±0.08盐藻粉99.8656723.44±26.90714.96±26.664.34±0.940.80±0.132.4.2门和属水平上硬壳蛤幼贝肠道微生物群落组成（见图1、图2）由图1可知，脱毒水华蓝藻粉组硬壳蛤幼贝肠道中优势菌门依次为变形菌门Proteobacteria（44.53%）、弯曲杆菌门Campylobacterota（29.41%）和厚壁菌门Firmicutes（14.74%）；螺旋藻粉组优势菌门依次为厚壁菌门Firmicutes（30.05%）、变形菌门Proteobacteria（27.00%）和拟杆菌门Bacteroidota（21.10%）；盐藻粉组优势菌门依次为变形菌门Proteobacteria（34.67%）、拟杆菌门Bacteroidota（27.09%）和弯曲杆菌门（16.30%）。仅有脱毒水华蓝藻粉组（0.001 1%）和螺旋藻粉组（0.0023%）硬壳蛤幼贝肠道中出现泉古菌门Crenarchaeota。对相对丰度前10优势菌门进行组间显著性差异分析，仅脱毒水华蓝藻粉组和螺旋藻粉组泉古菌门Crenarchaeota显著高于盐藻粉组（P0.05），其余各组间差异均不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.011.F001图1在门水平上硬壳蛤幼贝肠道微生物群落结构特征由图2可知，脱毒水华蓝藻粉组硬壳蛤幼贝肠道中优势菌属依次为Halarcobacter（14.95%）、黏着杆菌属（Cohaesibacter）（14.06%）和Malaciobacter（13.69%），螺旋藻粉组优势菌属依次为JTB215（23.82%）、Roseimarinus（17.18%）和Halarcobacter（10.32%），盐藻粉组优势菌属依次为Roseimarinus（24.34%）和Halarcobacter（15.51%）。对相对丰度前10位优势菌属进行组间显著性差异分析，仅盐藻粉组弧菌属（Vibrio）丰度显著高于脱毒水华蓝藻粉组和螺旋藻粉组（P0.05），其余各组间差异均不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.011.F002图2在属水平上硬壳蛤幼贝肠道微生物群落结构特征2.5硬壳蛤幼贝组织中MCs蓄积量与螺旋藻粉组和盐藻粉组相同，投喂脱毒水华蓝藻粉的硬壳蛤幼贝内脏团和闭壳肌中均未检测到MCs。3讨论3.1脱毒水华蓝藻粉MCs脱毒效果分析目前，国内外对水华蓝藻的脱毒多集中于MCs的化学或生物降解消除。化学方法氧化效率高，但可能形成溴酸盐副产物、氯化消毒副产物，还会导致可溶性蛋白质含量下降[16]，而微生物发酵脱毒处理后异味过大不适合作为饲料原料。本试验采取反复冻融法，主要通过破坏水华蓝藻细胞的细胞壁、细胞膜等释放出大量MCs[17]，离心后沉淀水华蓝藻泥中的毒素含量下降54.95%，适用于实验室中少量水华蓝藻的脱毒处理。3.2藻粉营养价值分析藻粉的蛋白质和脂肪含量是评估饵料营养价值的重要指标[18]，对贝类生长、摄食及提高机体免疫力具有重要影响[19]。自然条件下，贝类摄食单胞藻等饵料的蛋白质含量为15%~40%[20]。Camacho等[21]发现，蛤仔稚贝最低蛋白质需求量为22.00%，脱毒水华蓝藻粉、螺旋藻粉和盐藻粉粗蛋白含量分别为55.07%、65.07%和25.29%，均能够达到蛤仔稚贝最低蛋白质需求量，且脱毒水华蓝藻粉的粗蛋白含量与Cummins等[22]和De Moor等[23]的研究结果一致。Rivero等[24]认为，在稚贝阶段需要适当的脂质营养平衡，一般好的饵料脂肪含量应该达到8%干重[25]。脱毒水华蓝藻粉、螺旋藻粉和盐藻粉粗脂肪含量分别为0.2%、7.4%和0.5%，均不能达到好的饵料脂肪含量标准。脱毒水华蓝藻粉和螺旋藻粉氨基酸组成相似度较高，可能是因其均属于蓝藻门。脱毒水华蓝藻粉的EAA高达20.84%并且高于盐藻粉。研究表明，鼠尾藻（Sargassum thunbergii）EAA为6.37%[26]，链带藻EAA为10.99%[27]，均低于脱毒水华蓝藻粉，说明其具有渔用饲料蛋白源的潜在价值[28]。脱毒水华蓝藻粉EAA中比例最高的氨基酸是亮氨酸，亮氨酸对水产动物的健康有重要影响[29]。脱毒水华蓝藻粉脂肪酸总量最低，其中棕榈酸含量最高，特有的脂肪酸是十四碳一烯酸和花生一烯酸，但未检测到EPA。游江涛等[30]在两种水华藻——球形棕囊藻和铜绿微囊藻中也均未检测到EPA。3.3脱毒水华蓝藻粉对硬壳蛤幼贝生长、摄食及肠道微生物多样性的影响本试验中，从3种藻粉营养组成对比来看，脱毒水华蓝藻粉营养成分更接近螺旋藻粉。投喂脱毒水华蓝藻粉、螺旋藻粉和盐藻粉30 d后，脱毒水华蓝藻粉组摄食率显著高于盐藻粉组，且与其他各组间壳长、壳高和壳宽差异均不显著，说明3种藻粉在30 d试验中具有相同的促生长效果。动物肠道微生物的组成在宿主营养吸收和免疫等方面发挥重要作用[31-32]。本试验中，脱毒水华蓝藻粉组硬壳蛤幼贝的肠道内微生物的丰富度和多样性与螺旋藻粉组和盐藻粉组均无显著差异；在门水平下，3组硬壳蛤幼贝肠道中共有优势菌门为变形菌门（Proteobacteria），其中脱毒水华蓝藻粉组硬壳蛤幼贝肠道中变形菌门（Proteobacteria）丰度最高（44.53%）。变形菌门（Proteobacteria）在双壳贝类的肠道中均占主导地位[33-35]。脱毒水华蓝藻粉组的硬壳蛤幼贝肠道优势菌门与孙旭等[36]研究蓝藻堆积区河蚬肠道优势菌门结果一致，均为变形菌门（Proteobacteria），但前者含量明显低于后者（85.8%）。脱毒水华蓝藻粉组优势菌属为Halarcobacter、黏着杆菌属（Cohaesibacter）和Malaciobacter。黏着杆菌属曾在皱纹盘鲍[37]和海鲶[38]的肠道中被分离鉴定出，但目前关于Halarcobacter和Malaciobacter研究报道较少。梁山泉等[33]发现，鲜活牡蛎的肠道主要菌群包括Roseimarinus，与螺旋藻粉组和盐藻粉组和结果一致，进一步证明水产动物肠道微生物具有相似性。摄食饵料种类可影响肠道内微生物的优势种群组成[39-40]，但短期内摄食不同种类的微藻饵料不会对硬壳蛤幼贝的肠道菌群结构产生显著影响。3.4硬壳蛤幼贝蓄积MCs分析MCs可在水生动物体内累积。Miller等[5]发现，蛤蜊、贻贝、牡蛎和海螺均对MCs具有很强的生物富集效应。Williams等[6]发现，贻贝能够富集MCs浓度达16 μg/g。本试验的脱毒水华蓝藻粉MCs含量为3.378 μg/g，但在脱毒水华蓝藻粉组硬壳蛤幼贝组织中并未检测到MCs。原因可能是脱毒水华蓝藻粉MCs含量相对较低，养殖时间较短，硬壳蛤幼贝MCs摄入量较低；硬壳蛤幼贝肠道微生物可能对MCs具有一定的微生物降解作用。因此，投喂脱毒水华蓝藻粉组硬壳蛤幼贝组织内MCs蓄积量并未达到检测下限。4结论脱毒水华蓝藻粉与螺旋藻粉营养组成接近，硬壳蛤幼贝对其摄食率与螺旋藻粉组无显著差异，但明显高于盐藻粉组，均在促生长效果上无显著差异，具有作为微藻藻粉的潜在价值。分别投喂3种藻粉30 d后，硬壳蛤幼贝肠道优势菌门、菌属及其丰度均未发生显著变化，表明短期内摄食不同种类微藻藻粉不会对肠道菌群结构产生显著影响。以脱毒水华蓝藻粉投喂硬壳蛤幼贝30 d后，幼贝组织内未检测到MCs蓄积。本研究结果可为脱毒水华蓝藻粉阶段性替代微藻藻粉在贝类养殖生产应急处置中应用提供参考。