猪流行性腹泻病毒（PEDV）属尼多病毒目，冠状病毒科，α-冠状病毒属，是一种单股正链RNA病毒[1]。猪流行性腹泻（PED）是由PEDV引起的一种猪的急性肠道传染病，经过粪-口传播，直接或间接接触被病毒污染的水源、饲料、车辆、未消毒干净的栏舍以及感染母猪的乳汁等均可引起仔猪发病[2]。患病猪临床上主要表现呕吐、腹泻、全身性脱水等症状。PED并无明显季节性[3]，但以冬春多发；各个年龄段的猪均对PEDV易感。PED可使肥育猪体重下降，对哺乳仔猪危害较大，1周龄以内的仔猪病死率高达100%[4]。自2010年起，此病在我国许多猪场相继出现和暴发。有研究对国内11省的42个猪场进行了流行病学的调查，发现在调查的42个猪场中，共有36个猪场显示PEDV阳性，猪场阳性率为85.71%，表明PEDV在我国的猪腹泻病病原中仍占主导地位[5]。因PED病死率高、传染性强，对国内外生猪养殖业造成了一定经济损失。目前，PED主要依赖于疫苗进行预防，因PED的临床症状与猪其他胃肠疾病相似，如猪轮状病毒腹泻、传染性肠胃炎、细菌性腹泻等较相似，在临床上难以辨认，故对病原的快速准确鉴定尤为重要[6]。PEDV常见的检测方法有反转录－聚合酶链反应法（RT-PCR）、免疫荧光法（IF）、免疫吸附试验（ELISA）等[7]。RT-PCR法灵敏度高，准确性强，但需要专业的仪器和专业实验室人员操作，适用于实验室检测，不适合现场检测。IF特异性强，灵敏度高，操作过程安全，但需要专业的操作和昂贵的试验设备[8]。ELISA法具有较高的通量，适用于实验室大批量样品的筛查与检测，但需要酶标仪读数，并不适用于生产一线的现场检测[9]。胶体金免疫层析技术是一种以胶体金作为标记物的免疫层析技术，成本较低、操作方便易行、检测时间短，对设备仪器和操作人员要求低，适用于现场快速检测[10]。传统的胶体金免疫层析通常使用柠檬酸钠作为还原剂合成的金纳米颗粒作为标记材料，但该方法制备的胶体金颗粒存在粒径均一度较低、形状不规则等问题，且批间差异较大，导致胶体金标记物容易解离、沉淀，金标结合物就不能快速而完整的从玻璃纤维上解离，扩散不完全，反应区底色过深或者假阳，进而导致以此为标记的免疫层析试纸条的重复性和稳定性受到很大影响[11]。为解决上述问题，本试验通过改良胶体金的制备工艺，采用三羟甲基氨基甲烷（Tris）辅助法制备表面电荷稳定且形状大小均一的胶体金，以此作为标记材料研制新型胶体金免疫层析检测试纸条，用于PEDV的现场检测。通过对最佳标记pH值、最小蛋白量、最佳复溶比等工艺的优化，并对试纸条的敏感性、特异性、准确性等检测性能进行考察，最终研制出一种改良的可用于PEDV现场快速检测的新型胶体金免疫层析试纸条。本研究的意义在于利用新型胶体金作为标记材料，改善传统胶体金标记免疫层析技术敏感性低、重复性差等不足，提高PEDV胶体金免疫层析现场检测的准确度。1材料与方法1.1试验材料PEDV单克隆抗体Ab1、Ab2（金诺百泰有限公司）；羊抗鼠IgG（上海生工生物工程有限公司）；牛血清白蛋白、柠檬酸钠、四氯金酸等（Sigma公司）；硝酸纤维素（NC）膜（Sartorius公司）；样品垫、结合垫、吸水纸、聚氯乙烯（PVC）底板等（上海金标生物科技有限公司）。PEDV病毒由本实验室保存。临床粪便、血液和组织等样本，由生猪养殖企业和第三方动物检测企业提供。1.2主要仪器5430R高速冷冻离心机（Eppendorf公司）；ZQ2002微电脑自动斩切机、CTS300XYZ数控裁条机和HM3035三维化膜喷金仪（上海金标生物科技有限公司）；ZetasizerNanoZS马尔文纳米粒度电位仪（马尔文仪器公司）；HT7700日立透射电子显微镜（日立公司）、UV-1800紫外可见光分光光度计（岛津仪器有限公司）。1.3试验方法1.3.1胶体金溶液的制备与表征根据Lu等[12]报道的方法制备胶体金。量取140 mL纯净水于三颈烧瓶，温度137 ℃，搅拌转速为900 r/min。油浴温度到达100 ℃时，将10 mL 1%柠檬酸钠溶液加入三颈烧瓶。继续加热40 min，注入1 mL 1%的氯金酸溶液。反应60 s，将5 mL 0.1 mol/L的Tris-base溶液注入三颈烧瓶中的漩涡中心处；反应30 min后，温度设为100 ℃，随后快速将1 mL 1%的氯金酸溶液注至漩涡中心处；反应30 min，重复上一步骤；反应结束后，停止加热，在搅拌状态下自然冷却至室温，常温避光保存。利用紫外分光光度计扫描紫外吸收图谱，通过粒径分析仪测定粒径大小及分布情况，采用透射电镜观察其均一性和颗粒大小。1.3.2胶体金免疫层析试纸条的制备1.3.2.1胶体金免疫层析试纸条的制备流程首先制备胶体金标记猪流行性腹泻病毒单克隆抗体，以一定体积的复溶液重悬后，均匀喷涂于结合垫，37 ℃烘干3 h。利用接触式自动划膜仪将猪流行性腹泻病毒捕获抗体Ab2与羊抗鼠IgG包被在NC膜上作为检测线（T线）与质控线（C线），37 ℃烘干。将样品垫、固定有胶体金标记抗体的结合垫、包被有T线与C线的NC膜和吸水纸组装到PVC底板上，采用数控裁条机裁成3.0 mm宽的试纸条，干燥条件下避光保存。1.3.2.2最适标记pH值的确定取5只1.5 mL干净透明玻璃瓶，每瓶加入1 mL胶体金溶液，然后分别加入0、2、4、6、8和10 μL体积的K2CO3（0.1 mol/L）调整pH值，再加入5 μg猪流行性腹泻病毒特异性抗体Ab1。静置30 min，每瓶加入100 μL的10% BSA，混匀静置30 min，8 000 r/min下离心30 min，吸取上清液，以200 μL复溶液重悬金标溶液并将其均匀涂在结合垫，37 ℃烘干3 h，并制备成试纸条，根据对阴性样品和阳性样品的检测结果确定最适标记pH值。1.3.2.3最小标记蛋白浓度的确定取6只1.5 mL的透明玻璃瓶，每管加入1 mL胶体金溶液，加入上一步确定好的K2CO3 （0.1 mol/L）最佳体积，再分别加入2、4、8、12和14 μL浓度为2 g/L的猪流行腹泻病毒特异性抗体Ab1，并制备成试纸条根据显色结果确定最适标记蛋白浓度。1.3.2.4最佳复溶比例的确定以确定的pH值和蛋白量对PEDV Ab1进行标记，沉淀分别用200、400、600、800和1 000 μL的复溶液对1 mL胶体金标记离心后的沉淀进行重悬，均匀喷涂于结合垫，37 ℃烘干3 h后制备试纸条，根据检测结果确定最佳复溶比例。1.3.2.5最佳C线包被抗体浓度的优化取4条NC膜，在C线位置分别包被1.00、0.75、0.50和0.25 g/L羊抗鼠IgG，37 ℃干燥3 h。与制备好的结合垫组装成试纸条，根据显色结果确定最佳C线包被抗体浓度。1.3.2.6最佳T线包被抗体浓度的优化取4条NC膜，T线分别包被1.00、0.75、0.50和0.25 g/L猪流行性腹泻病毒捕获抗体Ab2，37 ℃烘干3 h后，组装成试纸条，根据显色结果确定最佳T线包被抗体浓度。1.3.3胶体金免疫层析试纸条的性能考察1.3.3.1灵敏度试验以1 mL载毒量3.2×106 TCID50/mL的PEDV病毒液经PBS 10倍倍比稀释后（分别为101、102、103、104和105倍），分别取60 μL病毒液滴加到样品垫，静置10 min，肉眼观察检测结果并拍照，确定试纸的检测灵敏性。1.3.3.2特异性试验利用制备好的试纸条，分别对阴性样品、葡萄球菌、副溶血弧菌、大肠杆菌、沙门氏菌、轮状病毒、猪圆环病毒、传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒进行检测，分析试纸条的特异性。1.3.3.3重复性试验取PEDV病毒液与等量的样品稀释液混合作为阳性样品，用样品稀释液做阴性样品。从同批次制备的试纸条中随机抽取6条试纸条，分为3组，分别对同一份阳性样品和阴性样品进行检测，考察试纸条的批内重复性。从3个不同批次制备的试纸条中，分别抽取2条试纸条，分别对同一份阳性样品和阴性样品进行检测，考查试纸条的批间重复性。1.3.3.4稳定性试验试纸条4 ℃保存，并分别在第1、3、6个月用阳性样品进行检测，同时做阴性对照，检测试纸条的稳定性。1.3.3.5临床样品的检测分别利用RT-PCR方法和本研究制备的胶体金免疫层析试纸条对收集到的107份临床样品进行检测，比较检测结果。2结果与分析2.1胶体金表征结果（见图1）由图1（a）可知，利用Tris辅助法制得的胶体金溶液呈清澈透亮的酒红色，且在室温避光条件下放置1个月无可见变化，无沉淀析出。由图1（b）可知，胶体金颗粒均为圆球形，且颗粒大小均匀，直径约40 nm。由图1（c）可知，利用粒径扫描仪对胶体金进行检测，发现Tris辅助法制备的胶体金集中在40 nm处作用，集中度高。由图1（d）可知，以Tris辅助法制备的胶体金的紫外吸收图谱，在可见光范围内只有一个尖锐的吸收峰，波长为520 nm，且无肩缝；表明所制备的胶体金粒径均一，与TEM和粒径扫描结果一致。图1胶体金表征结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.014.F1a1（a）胶体金的溶液（b）胶体金的透射电镜10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.014.F1a2（c）胶体金的粒径（d）胶体金紫外可见吸收2.2试纸条最适pH值试验结果（见图2）由图2可知，不同标记pH值下制备的试纸条对阴性对照检测结果相似，C线清晰且无假阳现象。阳性样品的检测结果发现，当1 mL胶体金溶液中添加2 μL 0.1 mol/L K2CO3时，C、T线最清晰，膜面干净，释放完全；当1 mL胶体金溶液中不添加0.1 mol/L K2CO3或者添加4 μL以上 0.1 mol/L K2CO3时，使胶体金溶液整体电荷大于猪流行性腹泻病毒特异性抗体Ab1的等电点，导致抗体和胶体金的结合效率降低，显色不清晰。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.014.F002图2试纸条最适pH值试验结果（a）阳性 （b）阴性注：从左至右0.1 mol/L K2CO3添加量分别为0、2、4、6、8、10 µL。因此，后续试验选择1 mL胶体金溶液中添加2 μL 0.1 mol/L K2CO3。2.3最小标记蛋白浓度的确定（见图3）由图3可知，在1 mL胶体金溶液中加入2 μL 0.1 mol/L K2CO3的基础上，添加4、6、8、10、12和14 μg猪流行性腹泻抗体Ab1时，发现随着添加蛋白量的增加，对阴性样品和阳性样品的检测结果均无明显差异，对阴性样品检测时C线显色清晰，无假阳现象；对阳性样品检测时，释放充分，膜面干净，C、T线显色清晰。从成本节约的角度考量，每1 mL胶体金溶液中加入4 μg猪流行性腹泻病毒特异性抗体Ab2已满足试纸条要求。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.014.F003图3最小蛋白量试验结果（a） 阳性 （b） 阴性注：从左至右分别加入0、4、6、8、10、12、14 μg猪流行性腹泻病毒特异性抗体Ab1。因此，在此基础上增加20%，即每1 mL胶体金溶液中添加5 μg PEDV Ab1作为后续试验的标记条件。2.4最佳复溶浓度的确定（见图4）由图4可知，复溶比例越大，对阴性样品检测时C线越清晰，但均无假阳性出现，膜面干净，均能达到要求。但从阳性样品检测结果发现，用200 μL复溶液进行重悬制备的试纸条阳性C、T线显色最均匀和清晰，膜面干净，释放完全，而用1 000、800、600、400 μL体积的复溶液会导致T线显色不如用200 μL复溶液重悬制备的试纸条清楚，颜色较浅，所以最佳的复溶液体积确定为200 μL。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.014.F004图4最佳复溶浓度的确定结果注：从左至右复溶液的体积分别为1 000、800、600、400和200 μL。2.5C线包被抗体浓度的优化（见图5）采用系列浓度羊抗鼠IgG包被C线区域的试纸条对同一份阳性和阴性样品进行检测。由图5可知，C线划膜浓度为0.10 g/L时，阳性样品对照C线呈浅红色；C线划膜浓度为0.25~1.00 g/L时，质控线和检测线的显色清晰且明显，且阴性对照膜面干净且释放完全，所以0.25 g/L是陈本最低的C线包被浓度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.014.F005图5C线包被抗体浓度的优化结果注：从左至右C线的划膜羊抗鼠抗体浓度分别为0.25、0.50、0.75、1.00 g/L。2.6最佳T线包被抗体浓度的优化（见图6）将不同浓度的PEDV Ab2喷涂在T线区域并对同一份阳性样品与阴性样品进行检测。由图6可知，T线划膜浓度为1.00、0.75、0.25 g/L时，阳性样品对照C线显色不明显，阳性对照检测线颜色很浅；T线划膜浓度为0.5 g/L时，质控线和检测线的显色清晰且明显，且阴性对照膜面干净且释放完全，是最佳T线包被浓度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.014.F006图6T线包被抗体浓度的优化结果注：从左至右T线的抗体浓度分别为1.00、0.75、0.50、0.25 g/L。2.7试纸条的性能考察2.7.1敏感性考察（见图7）采用优化工艺制备的试纸条对10倍倍比稀释的浓度为1×104 TCID50/ml的病毒液进行检测，通过观察结果考察试纸条的敏感性。由图7可知，当病毒稀释1、10和100倍时，T线均显色清晰。当病毒液稀释100倍时，即病毒浓度为1×102 TCID50/mL时，仍能观察到较明显的T线。但当病毒液稀释1 000倍时，在自然光线下无法观察到明显检测线。因此，所制备试纸条对PEDV的最低检测限定为1×102 TCID50/mL。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.014.F007图7试纸条敏感性试验结果注：从左至右对应的阳性样品稀释倍数为1、10、100、1 000、10 000倍和阴性。2.7.2特异性考察（见图8）由图8可知，所制备的PEDV胶体金试纸条对样品样品的检测出现了清晰的T线，而对葡萄球菌、副溶血弧菌、大肠杆菌、沙门氏菌、轮状病毒、猪圆环病毒、传染性胃肠炎病毒的检测结果与阴性对照样品检测结果一致，即出现清晰的C线，但在T线位置都无红色条带。因此，所制备的胶体金免疫层析试纸条与常见病原无交叉反应，具有较高的特异性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.014.F008图8特异性试验结果注：从左至右分别为阴性样品、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、大肠杆菌、沙门氏菌、轮状病毒、猪圆环病毒、传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒。2.7.3重复性考察（见图9、图10）由图9、图10可知，同一批次的试纸条和不同批次的试纸条对同一份阳性样品和阴性阳性的检测结果基本一致，表明所制备的试纸条重复性好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.014.F009图9批内试验结果注：从左至右分别为同一批试纸条的3组对同一份阴性和阳性样品的检测结果。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.014.F010图10批间试验结果注：从左至右分别为第1、2、3批试纸条分别对阴性样品和阳性样品的检测结果。2.7.4稳定性考察（见图11）将试纸条在4 ℃条件下干燥避光保存，第30、60、90 d随机抽取试纸条，对阴性及阳性样品进行检测。由图11可知，阴性样品C线显色明显、无假阳现象，阳性样品C线、T线显色均明显；结果显示，该试纸条在4 ℃干燥避光保存条件下，稳定性良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.014.F011图11试纸条稳定性试验结果（a）常温存放1个月 （b）在4℃存放3个月 （c）常温存放6个月2.7.5临床样品检测结果（见表1）同时采用本研究制备的胶体金免疫层析试纸和常规RT-PCR方法，对107份临床样品检测。由表1可知，两种方法阳性符合率为100%，说明本试验制备的胶体金免疫层析试纸条比较准确度高，实用性强，可应用于实际样品检测。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.014.T001表1临床样品检测结果项目+-合计合计9215107胶体金免疫层析试纸条+92092PCR-01515注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。3讨论猪流行性腹泻病毒对各年龄段的猪均具有感染性，对哺乳仔猪的危害最大，发病率和病死率均较高，对生猪养殖业造成了巨大的经济损失。病猪是主要传染源，病毒存在于肠绒毛上皮和肠系膜淋巴结，随粪便排出后，污染环境、饲料、饮水、交通工具，病毒还可随气溶胶传播到邻近猪舍、猪场与农户[13]。若无法及时检测出此病毒，则可能引起大规模的传播，造成更严重的经济损失，故准确快速的现场检测手段尤为重要。常规的PCR与ELISA检测方法需要专业的设备和检测人员，小型养殖场与个体户并不具备检测条件，并且实验室检测手段也不适用小批量分散型的检测[14]。近年来，由于胶体金免疫层析技术具有快速、方便和易操作的优点，被广泛应用于兽医各领域的检测。有学者采用柠檬酸还原法制备胶体金并结合单克隆抗体制备技术制备出检测TEGV的胶体金试纸条，灵敏度与RT-PCR检测结果一致，性能优于进口试纸条[15]。Li等[16]采用PEDV的重组蛋白与胶体金技术结合研制出的试纸条，灵敏度高于市售的ELISA试剂盒。有相关研究人员利用细胞表面荧光免疫分析技术制备PEDV单克隆抗体，使用胶体金标记单克隆抗体，研制出一种可以检测猪粪便的新型免疫层析方法，灵敏度可以检测到7.8×103TCID50/mL[17]。本试验采用Tris辅助法制备的新型胶体金代替传统的柠檬酸钠还原法制备的胶体金作为标记材料，新型胶体金具有粒径均匀，形状规则与大小均一的优点，与抗体的结合结合能力更强，作为免疫标签建立的猪流行腹泻病毒胶体金免疫层析检测试纸条灵敏度可提升到1×102 TCID50/mL。结果表明，本试验制备的胶体金试纸条稳定性高，分散性好。由于金球大小均一，表面电荷均一稳定，新型胶体金大小均一新型胶体金与抗体结合更加牢固且不易脱落，金标复合物在NC膜上释放性好，不会发生团聚，显色更清楚，与Xu等[18]研究的铕纳米粒子荧光探针免疫色谱分析法的检测限达到相同的检测量级。此金球制备的免疫层析试纸条，使用操作简便，无需对样品进行洗脱、离心等前处理，可广泛应用于猪场的养殖生产，也很好地弥补了PCR与ELISA的检测结果具有明显滞后性的不足。4结论本试验基于Tris辅助法制备的胶体金所建立的猪流行性胶体金免疫层析试纸条具有良好的特异性，最低可以检测到1×102 TCID50/mL的病毒量，显色清晰，且与常见的临床症状相似的病毒与细菌无交叉反应；在4 ℃存放下稳定性好，存放时间长，批内批间重复性好，结果一致，且制作成本低，可应用于猪流行性腹泻病毒发生的快速现场检测，适合早基层兽医站，养殖散户与中小型企业的使用。