绵羊是重要的产肉动物之一,在畜牧生产中占有重要地位。陶塞特、萨福克羊具有生长速度快、肉用性能好的特点,常作为父本进行肉羊杂交[1-2]。湖羊是有名的多胎绵羊品种,母羊具有适应性强、四季发情、泌乳性能好、肉质鲜美等特点,常作为肉羊杂交的母本[2-3]。与湖羊相比,杂交一代羊的生产性能、肉用性能等均有不同程度提高[2,4-5]。羊肉中富含人体健康所需的蛋白质、脂肪酸等营养物质,胆固醇含量较低,肉质鲜美。近年来,人们对羊肉消费需求持续增长。羊肉的肉质性状主要包括肉色、pH值、系水性、熟肉率和剪切力等指标[6]。品种、性别、年龄、饲料类型等因素均可影响羊肉的肉质[7]。近年来,转录组测序技术发展较快,经常应用于一些功能基因的挖掘[8-9]。李国辉等[10]利用RNA-seq技术对金茅黑鸡进行研究,筛选出了与肉质相关基因。王思元等[11]利用RNA-seq技术分析安格斯牛和西门塔尔牛脂肪组织的差异研究,揭示了肉牛不同脂肪组织中复杂的转录组图谱,发掘了参与脂肪沉积的候选基因。刘远等[12]利用RNA-seq技术分析福清山羊和努比亚黑山羊背最长肌,筛选出了与肉质形成和生长发育相关的信号通路。本研究采集陶塞特与湖羊杂交F1代羔羊和萨福克与湖羊杂交F1代羔羊背最长肌组织,基于转录组测序技术,探索影响羔羊肉质的功能基因,以期为羔羊肉用性能选育提供参考。1材料与方法1.1试验动物本试验选择环县恒基肉羊养殖专业合作社饲养条件相同、健康无病、月龄相同的龄陶塞特与湖羊杂交F1代羔羊(TH)和萨福克与湖羊杂交F1代羔羊(SH)各3只屠宰,取背最长肌组织,剔除筋膜,放入液氮,-80 ℃超低温冰箱保存。1.2试验方法1.2.1肉质性状测定样品采集后送至兰州畜牧与兽药研究所进测定粗脂肪、粗蛋白等肉质性状指标。1.2.2总RNA的提取利用Trizol法提取总RNA,利用Agilent 2100 bioanalyzer检测RNA质量。1.2.3cDNA文库构建及转录组测序建库利用Illumina测序,由北京诺禾致源有限公司完成。1.2.4测序数据处理测序完成后,对测序数据进行测序错误率分布检查、碱基含量分布检查,对原始数据进行过滤,使用HISAT2软件将Clean Reads与参考基因组比对定位。1.2.5生物信息学分析计算各转录本在样本中的表达丰度,以FPKM值表示。利用DESeq软件分析差异表达情况。以FPKM值为依据,做层次聚类(hierachical clustering)分析。采用cluster Profile软件对差异基因集进行GO功能和KEGG通路分析。1.2.6实时荧光定量PCR选择4个差异表达基因进行qPCR试验。引物由Probegene设计,上海生工合成。qPCR反应体系(10 μL):2×SYBR Green qPCR Master Mix 5μL,上下游引物各0.1 μL,模板DNA1 μL,加ddH2O至10 μL。反应程序为:95 ℃预变性10 min;95 ℃变性15 s,退火30 s,共40个循环。引物信息见表1。结果利用2-△△Ct法计算。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.013.T001表1引物信息基因引物(5'→3')产物长度/bp退火温度/℃GAPDH(内参基因)F:ACCAGGGCTGCTTTTAATACTR:TTGACTGTGCCGTGGAACTT12860LIPGF:CAGCCATTTCCCACCAACATR:TGCCATCACAACTCCTTCCA16560SCDF:GATGACATCTATGACCCAACTTACCR:CACATAGTAGAATAACACCCAGAGA17460LPLF:CAACAAGGTCAGAGCCAAAAR:CAGGCAGGGTAAAAGGGATG19460DDOF:AGTGGCAGAGTTGCTGTGATR:GCTGAAGGGAAGTAGAGGTT156602结果与分析2.1陶湖F1代与萨湖F1代羔羊背最长肌肉品质分析(见表2)由表2可知,陶湖F1代羔羊的剪切力显著低于萨湖F1代羔羊肉(P0.05),其他指标差异不显著(P0.05);但陶湖F1代羔羊肉的蛋白质和脂肪含量均高于萨湖F1代羔羊,滴水损失小于萨湖F1代羔羊。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.013.T002表2陶湖F1代与萨湖F1代羔羊肉品质分析项目陶湖F1代萨湖F1代剪切力/N54.45±0.61b55.65±0.32apH值6.14±0.026.12±0.04滴水损失/%1.12±0.031.14±0.02钙/%0.004 1±0.001 10.004 3±0.001 2磷/%0.074±0.0050.068±0.007粗蛋白质/%21.50±3.4721.20±4.04粗脂肪/%2.40±4.582.10±0.61粗灰分/%1.10±0.021.10±0.09注:同行数据肩标不同字母表示差异显著(P0.05),无字母表示差异显不显著(P0.05);下表同。2.2背最长肌RNA样品检测结果(见表3)由表3可知,Agilent 2100 bioanalyzer分析显示:28S/18S比值为1.0~1.6,均大于阈值0.7;RNA完整性值为7.60~8.30,均大于阈值7,提取的RNA纯度和完整度均符合建库测序的要求,可应用于下一步RNA-seq试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.013.T003表3RNA质量检测报告样品完整性值28S/18S检测结论TH17.901.4ATH28.201.0ATH38.101.1ASH18.301.2ASH27.601.6ASH37.801.2A2.3背最长肌转录组测序数据统计(见表4)由表4可知,每个样本过滤后的reads数占原始数据中reads比例均大于95.18%,过滤后的碱基数在6.02 G以上,所有样本碱基占总碱基的百分比为94.18%~94.98%,G与C含量在每个样本中所占比例维持在52.12%以上,符合测序要求。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.013.T004表4RNA-seq产出数据质量评估样品原始数据中reads数/Mb过滤后reads数/Mb过滤后碱基数/G测序错误率/%碱基占总碱基的百分比/%G与C占4种碱基的百分比/%TH153 841 19052 402 7887.860.0294.9853.17TH247 458 85446 174 6686.930.0294.5954.24TH350 117 47448 488 6767.270.0394.2554.82SH141 511 73640 103 6866.020.0394.1853.86SH242 272 27840 236 8666.040.0294.5052.12SH341 478 44040 228 9706.030.0294.6153.622.4背最长肌差异表达基因火山图(见图1)由图1可知,在陶湖杂交F1代羔羊(TH)与萨湖杂交F1代羔羊(SH)之间共筛选出552个差异表达基因,其中385个上调基因,167个下调基因。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.013.F001图1背最长肌差异表达基因火山图2.5差异基因聚类(见图2)由图2可知,同一杂交组合羔羊的3个样品聚在同一簇中,表明本试验采集的样本准确性和可靠性较高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.013.F002图2背最长肌差异表达基因聚类热图注:纵坐标为差异基因FPKM归一化后的数值,颜色深浅代表表达量不同。2.6转录组测序结果qRT-PCR验证(见表5)由表5可知,两组数据表达趋势一致,表明转录组测序结果准确。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.013.T005表5转录组测序结果qRT-PCR验证基因转录组测序RNA -Seq荧光定量PCR(相对表达量)表达倍数log2FC(TH/SH)THSHLIPG-1.690.551.00DDO-1.690.221.00SCD1.871.081.00LPL2.601.581.002.7差异表达基因GO功能富集分析(见图3)10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.013.F003图3差异表达基因GO功能富集分析图试验有484个基因被GO数据库注释,在生物过程(BP)、细胞组分(CC)、分子功能(MF)上各富集203、38、150个。分别选取最显著的10个条目绘制图形。BP中的DEGs主要富集在免疫反应、蛋白质折叠、抗原加工和呈递、Ras蛋白信号转导的调控等条目;CC中的DEGs主要富集在MHC蛋白复合物、质膜蛋白复合物、肌球蛋白复合物、肌动蛋白细胞骨架等条目上;MF中的DEGs主要富集在未折叠蛋白结合、细胞外基质结构成分、G蛋白偶联受体结合、嘌呤核苷结合、GTP绑定等条目上。2.8差异表达基因KEGG富集分析(见图4、表6)将筛选到的差异表达基因对比到KEGG数据库中,经分析发现有236个差异表达基因被注释到KEGG数据库的200多个通路。由图4可知,图中含有所有通路中显著性KEGG通路富集的padj值(P值)最小的20个通路,其中大部分为人类疾病相关的通路。由表6可知,所有通路中筛选与肉质相关的通路主要为PPAR信号通路、AMPK信号通路、碳水化合物消化吸收、MAPK信号通路、脂类代谢通路等。筛选到与肉质相关的基因有SCD、LIPG、LPL基因。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.013.F004图4差异表达基因KEGG富集图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.013.T006表6差异表达基因KEGG信号通路信号通路基因表达基因注释PPAR信号通路上调LOC101115982、SCD、LPL甘油酯代谢下调LIPG、LPL磷脂酰肌醇信号系统上调PRKCB、INPP5D醚脂代谢上调PLA2G4DTGF-β信号通路上调FMOD脂肪细胞中脂解的调节上调ADCY7甘油磷脂代谢上调PLA2G4D、PLA2G5AMPK信号通路上调SCD鞘糖脂生物合成-神经节系列上调ST6GALNAC6胆固醇代谢上调LOC101115982、LPLα-亚麻酸代谢上调PLA2G4D不饱和脂肪酸的生物合成上调SCD磷酸肌醇代谢上调INPP5D、PIK3CG亚油酸代谢上调PLA2G4D碳水化合物消化吸收上调PRKCB花生四烯酸代谢上调PLA2G4D、LOC101110434醚脂代谢上调PLA2G4D脂肪酸代谢上调SCD脂肪细胞中脂解的调节上调ADCY7甘油磷脂代谢上调PLA2G4D丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢下调DDOMAPK信号通路上调MAP3K143讨论羊肉的肉质性状主要包括保水性、pH值、系水性、脂肪酸组成和剪切力等指标[6],品种、性别、年龄、饲料类型等因素均可影响羊肉的肉质[7]。研究表明,在家畜胴体中肌内脂肪(IMF)所占的比例较低,但IMF对肉品的风味和食用性有很重要的影响[13]。IMF对肉质的口感、风味、嫩度等具有重要作用,已成为肉品质性状重要的参数[14-15]。本研究通过RNA-Seq技术共筛选到552个差异表达基因,其中385个上调控表达,167个下调控表达。KEGG富集分析显示与肉质相关的通路主要为PPAR信号通路、AMPK信号通路、碳水化合物消化吸收、脂类代谢通路等,筛选得到与肉质相关的基因包括SCD、LIPG、LPL。SCD是一种分布于内质网上的内在膜蛋白,是催化饱和脂肪酸(SFAs)转化成单不饱和脂肪酸(MUFAs)关键酶[16],对机体中甘油三酯、胆固醇酯等脂代谢相关过程发挥重要作用[17]。研究显示,SCD的活性和表达量与脂肪沉积具有正相关性,与单不饱和脂肪酸含量也呈正相关性[18]。研究发现,SCD是SREBP-1C(脂肪生成转录因子)的靶基因,当敲除小鼠SCD后,SREBP-1C的表达水平显著降低,但其表达和活性可以被油酸激活。油酸合成的关键酶是SCD,对SREBP-1C的表达与活性的调控可以通过对油酸合成的调控进行,最终影响脂肪生成[11,19-20]。张静静等[21]对西门塔尔牛的研究发现,SCD1基因对肉品质具有一定影响,可作为肉质候选基因。王位[22]对4种绵羊之间的差异表达基因进行研究,发现SCD基因参与脂质代谢及酸类有机物等过程的调节,证明SCD基因可作为肉质性状的重要候选基因。因此,SCD基因对肉质性状有显著影响,可通过调控SCD基因的表达调节脂肪生产,进而影响肉品质。本研究中,SCD基因在陶湖F1代肉羊背最长肌中的相对表达量高于萨湖F1代肉羊,表明SCD基因可以促进脂肪沉积。LIPG是脂肪酶家族的新成员,与LPL和HL有高度同源性[23],主要参与的代谢有脂蛋白代谢、炎症、胰岛素抵抗等[24-25]。由LIPG基因编码的成熟蛋白-EL,可调节高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的代谢,其主要表现为磷脂酶活性,能够水解高密度脂蛋白(HDL)[23,25-26]。LIPG基因对脂质代谢具有调控作用,主要促进脂类代谢及水解细胞外磷脂,推测LIPG基因在脂肪分解代谢中具有重要作用。目前对LIPG的研究主要集中于人类脂质代谢疾病如冠心病等方面,在动物方面的研究仍需要进一步挖掘。本研究中,陶湖F1代肉羊背最长肌LIPG基因的相对表达量低于萨湖F1代肉羊,推测LIPG基因低表达可以促进背最长肌的脂肪沉积。LPL是一种参与脂肪沉积、由多种细胞合成和分泌的糖蛋白,能够影响脂肪代谢[27]。姚焰础[28]研究发现,肌内LPL基因表达量随羔羊的生长发育有明显提高,说明LPL基因表达对脂肪代谢具有影响。张珈溯等[29]研究发现,延边黄牛的LPL基因多态性与肉质性状存在显著相关。本研究中,陶湖F1代肉羊背最长肌LPL基因的相对表达量高于萨湖F1代肉羊,说明LPL基因可促进脂肪沉积。本研究分析发现,SCD、LIPG、LPL基因在陶湖F1代和萨湖F1代羔羊背最长肌均有表达,SCD和LPL基因上调,LIPG基因下调;qPCR显示SCD和LPL在陶湖F1代羔羊背最长肌的相对表达量高于萨湖F1代羔羊,LIPG基因在陶湖F1代羔羊背最长肌的相对表达量低于萨湖F1代羔羊,肉品质分析显示陶湖F1代羔羊背最长肌的剪切力小于萨湖F1代,蛋白质和脂肪含量高于萨湖F1代羔羊,滴水损失小于萨湖F1代羔羊。推测SCD、LPL基因的高表达和LIPG基因低表达对羊肉的肌内脂肪沉积具有重要作用,进而影响羊肉的品质。4结论本研究通过对陶湖F1代羔羊和萨湖F1代羔羊背最长肌进行转录组测序分析,筛选到552个差异基因,其中385个上调,167个下调。利用GO和KEGG分析,筛选出3个与肉质相关的基因,分别为SCD、LIPG、LPL基因,SCD和LPL在陶湖F1代羔羊背最长肌的相对表达量高于萨湖F1代羔羊,LIPG基因在陶湖F1代羔羊背最长肌的相对表达量低于萨湖F1代羔羊。SCD、LIPG、LPL基因对羔羊的肉质形成具有重要作用,可作为肉质性状的候选基因。

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