植物初生细胞壁中果胶约占35%。果胶经果胶酶分解，植物细胞壁分离[1]。果胶酶（pectinase）是分解果胶的一类多酶复合体系，通过其联合作用可分解植物纤维中的果胶质[2-3]。果胶广泛存在于植物细胞壁，抑制营养物质的释放，且黏度较强，影响食物在动物胃肠道中的消化蠕动。果胶易吸水膨胀形成凝胶，降低消化酶与食物的接触率，是畜禽饲料中主要的抗营养因子，导致动物消化不良。利用果胶酶提高植物性饲料的利用率，解除果胶的抗营养作用，已成为饲料研究领域的热点之一[4-7]。闫昭明等[8]研究表明，在动物饲粮中添加适量果胶酶可提高畜产品品质。张玉丹等[9]研究显示，添加果胶酶对棉杆中的果胶类物质进行酶解处理，可显著降低动物饲料中的果胶含量，为后续动物饲料补充一定的营养成分。梅宁安等[10-11]研究表明，在饲料中添加果胶酶可显著提高肉仔鸡的生长性能，降低死淘率，提高肉鸡养殖效益。雷廷等[12]研究表明，添加果胶酶可使肉鸡对饼粕类饲料的代谢能和氨基酸消化率不同程度地提高。蓝丽精[13]研究显示，动物饲料中添加果胶酶可降低饲料黏度，促进动物消化吸收。高纤维饲粮添加果胶酶可促进鹅生长，提高鹅对营养物质的消化吸收率，改善屠宰性能及肉品质[14-15]。果胶酶现已广泛应用于饲料行业、果酒果汁制品生产、食品加工和天然产物提取等领域[1-3,16-17]。本试验从宜州当地购买的高效酒饼粉中筛选果胶酶生产菌，以寻找新的产果胶酶生产菌，完成菌种鉴定及发酵条件初步优化。1材料与方法1.1试验材料市售高效酒饼，宜州产新鲜百香果皮。1.2主要仪器Tecan Infinite M200 Pro全波长酶标仪（TECAN公司）、Microfuge 20R高速冷冻离心机（贝克曼库尔特有限公司）、ZXSD-A1160曲线控制生化培养箱（上海市智城分析仪器制造有限公司）、pHS-25酸度计（上海市精密科学仪器有限公司）、ZWY-2102型立式全温度恒温摇床（上海智城分析仪器制造有限公司）。1.3培养基筛选培养基：果胶2.0 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、K2HPO4 1.0 g、MgSO4 0.5 g、NaNO3 3.0 g、琼脂粉20.0 g，蒸馏水定容至1 L，pH值6.0[13,18]。斜面培养基：蛋白胨1.5 g、酵母膏0.5 g、氯化钠1 g、琼脂2 g、蒸馏水100 mL。种子培养液：果胶0.2 g、蛋白胨1 g、(NH4)2SO4 1 g、K2HPO4·3H2O 0.2 g、KH2PO4 0.8 g、蒸馏水100 mL，pH值6.0。发酵培养基：百香果皮100 g、米糠40 g、(NH4)2SO4 1 g、K2HPO4·3H2O 0.5 g、KH2PO4 0.5g、蒸馏水100 mL，pH值6.0。1.4试验方法1.4.1果胶酶活测定[19]取0.2 mL发酵滤液和1.8 mL 1 g/L的果胶溶液（以0.2 mol/L、pH值4.4醋酸-醋酸钠缓冲液配置），于比色管中50 ℃水浴预热5 min，混匀准确反应30 min；加入3.0 mL DNS试剂，沸水浴10 min，取出冷却后定容至10 mL。以灭活的粗酶液为对照，每管设3个平行测定OD540 nm值。在该反应条件下，1 mL粗酶液1 min水解果胶生成1 μg D-半乳糖醛酸定义为1个酶活力单位（U）[20]，根据公式[21]计算酶活。酶活=A×N×1 000/T×V (1)式中：A为D-半乳糖醛酸的含量（由标准曲线算得）；N为酶液稀释倍数；1 000为mmol与μmol的转换倍数；T为反应时间；V为酶液体积。1.4.2产果胶酶菌株的筛选取样稀释成10-3~10-6浓度梯度涂布筛选平板，30 ℃倒置培养3~5 d，挑取单菌落划线分离，采用点接法接种，得到单菌落后采用卢戈氏碘液[22]染色，30 ℃培养15 min，倒掉染液。生理盐水洗涤，在筛选平板上可观察到透明圈，测量透明圈直径（D），选取D/d（d为菌落直径）相对较大的菌株液体发酵培养基摇瓶发酵测其果胶酶活，选取酶活最高的菌株进行后续试验。1.4.3菌种鉴定将酶活最高的菌株接种划线到含有2%果胶PDA平板上，30 ℃倒置培养3~4 d，定期观察菌落形态，制作装片进行革兰氏染色后用光学显微镜观察。培养好的菌种送至广西南宁国拓生物有限公司测序，序列在NCBI中BLAST进行比对，在比对结果中下载同源性较高的序列，采用邻位相连法将目的菌种的16S rDNA与下载的序列一起构建进化树，利用Bootstrp自举法检测序列1 000次后建立系统进化树。1.4.4发酵产酶条件研究1.4.4.1单因素试验按接种量5%、初始pH值6、发酵温度30 ℃、培养时间3 d为单一变量，分别研究培养时间（24、36、72、84、96、106 h）；接种量（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL）；发酵温度（24、27、30、33、36 ℃）；发酵初始pH值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）对产果胶酶酶的影响。1.4.4.2正交试验根据上述单因素试验结果，利用正交设计软件设计4因素3水平L9（34）正交试验，进行培养条件优化。2结果与分析2.1D-半乳糖醛酸的标准曲线（见图1）由图1可知，D-半乳糖醛酸标准曲线，依据曲线计算果胶酶酶活。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.016.F001图1D-半乳糖醛酸标准曲线2.2菌株筛选结果（见图2、表1）初筛分离得到的6株菌株（A、B、C、D、E、F），将其分别点接于果胶琼脂培养基平板上培养2 d，经卢戈氏碘液染色后产生透明圈。由图2可知，菌株A、C和E虽然能够在筛选培养基上生长，但是染色后无明显透明圈，未达到筛选效果；菌株B、D和F能够产生透明圈。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.016.F002图2各菌株产透明圈情况在以果胶以唯一碳源的培养基上果胶酶产生菌种能够将培养基中的果胶物质分解成小分子物质，碘液可将其小分子物质氧化，而果胶等大分子聚合物无法被氧化，于是将碘液倒入点接有产果胶酶菌种的筛选培养基中，在30 ℃下培养15 min在可观察到明显透明圈，D/d值越大酶活越高[23]。由表1可知，菌株B、D和F的Dp/Dc值分别为1.95、3.11和1.04，故选择菌株B、D和F进行复筛。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.016.T001表16株菌株Dp/Dc值编号Dp/cmDc/cmDp/DcA—0.31—B2.131.091.95C—0.19—D4.351.403.11E—6.90—F2.512.401.04注：“—”表示未筛选标记。2.3复筛酶活比较（见图3）果胶酶能裂解果胶大分子中的长链糖苷键使其还原端基不断暴露。因此，可通过检测果胶酶降解长链糖苷键产生的还原端基的量评价果胶酶酶活性的高低[21]。由图3可知，菌B、D和F菌株的酶活分别为：60.15、81.43、58.67 U/mL。因此，选用酶活最高的菌种D进行下一步试验，将其标记为JYJ。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.016.F003图3复筛酶活比较2.4菌种的鉴定2.4.1菌株JYJ形态学观察（见图4）由图4（a）、（b）可知，菌株JYJ中央凸起，菌落正面、反面、中央以及菌落的边缘部位颜色比较均一，均为浅土黄色；菌落表面光滑湿润，接种针挑起时菌落呈黏稠状，不与培养基结合。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.016.F004图4菌株JYJ形态学观察由图4（c）可知，菌体被染成紫色，为革兰氏阳性菌；在光学显微镜油镜观察到菌株细胞呈杆状，根据《伯杰细菌鉴定手册》初步判断为芽孢杆菌[24]。2.4.2菌株JYJ 16S rDNA序列系统进化树（见图5）由图5可知，菌株JYJ的16S rDNA序列与纺锤形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis）的16S rDNA序列相似性最高（99%），鉴定其为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.016.F005图5菌株JYJ 16S rDNA序列系统进化树2.5发酵产酶条件的优化结果分析2.5.1单因素试验2.5.1.1培养时间对产酶的影响（见图6）由图6可知，该菌株在不同时期有不同的产果胶酶活。72 h时，该菌株的产果胶酶活最高为98.07 U/mL。根据发酵工程原理可推断，24~120 h为生长指数期，此时菌株不断生产繁殖；72 h后进入稳定期，不断积累次级代谢产物；经过稳定期即96 h后，可能是由于培养基内的营养物质匮乏和有害代谢产物的积累抑制了果胶酶的生成，该菌株产果胶酶活逐渐降低。综上所述，该菌最佳产果胶酶时间为72 h。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.016.F006图6培养时间对产酶的影响2.5.1.2接种量对菌株产酶的影响（见图7）由图7可知，最佳接种量为6%，产果胶酶酶活最高为95.87 U/mL。在接种量3%~8%时，果胶酶活先上升后下降的原因可能是以3%接种量发酵培养，菌体在生长前期扩增的数量较少，产果胶酶活也较低；当接种量达到7%~8%时，果胶酶活逐渐降低，分析原因可能是大量菌体在前期不断扩增繁殖消耗了培养基内的营养物质。当菌种进入稳定期后，由于缺乏某种营养成分，最终影响果胶酶酶的合成，其次在菌种应缺少某种营养物质产生其他代谢产物，而代谢产物的产生对果胶酶的合成存在反馈抑制作用。综上所述，最佳接种量为6%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.016.F007图7接种量对菌株产酶的影响2.5.1.3培养温度对菌株产酶的影响（见图8）由图8可知，培养温度为30 ℃时，果胶酶活达到顶峰99.52 U/mL；当温度为33~36 ℃时，果胶酶活逐渐降低。由此可推断，此酶发酵产果胶酶的最适温度为30 ℃。分析原因可能是该菌株湿润黏稠，在室温和湿度较高的环境中生长状态较好，温度过高过低均可影响该菌株细胞膜的流动性和细胞内物质的运输，其次温度还会影响发酵液的黏度和氧的溶解速率等理化性质，最终影响菌种的生长繁殖和产物的合成速率。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.016.F008图8培养温度对菌株产酶的影响2.5.1.4培养基pH值对菌株产酶的影响（见图9）由图9可知，该目的菌种的产果胶酶活受不同pH值影响。pH值4.5~6.0时酶活不断升高，pH值在6.0时酶活达到顶峰99.84 U/mL，pH值5.0~8.0时该菌种产果胶酶能力逐渐降低。因此，该菌的最适发酵pH值为6，偏弱酸性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.016.F009图9pH值对产酶的影响分析其主要原因可能包括：该发酵培养基中有生橘皮粉和米糠等原材料，经过高位灭菌后会改变整个发酵液的pH值升高，影响菌种对上述物质的吸收利用；发酵培养基的溶液中含有磷酸二氢钾和磷酸氢二钾等无机盐能中和过量的酸起到缓冲作用。2.5.2正交试验结果与分析（见表2~表4）根据单因素试验结果，以发酵产物中的果胶酶活为评价指标，利用正交设计软件设计L9(34)正交试验，见表2、表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.016.T002表2正交试验因素水平设计水平因素A培养时间/hB接种量/%C发酵温度/℃D初始pH值1485275.52726306.03967336.510.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.016.T003表3正交试验结果试验号ABCD酶活/(U/mL)1111191.262122297.483133396.3242123114.6052231110.186231297.987313284.378321394.859332180.76K195.0296.7494.7094.07K2107.59100.8497.6193.28K386.6691.6996.96101.92极差（R）20.9279.1502.9168.646主次因素ABDC最优组合A2B2C2D3由表3可知，极差（R）大小顺序依次为ABDC，据此可以判断出影响产果胶酶活变化因素的大小顺序为：培养时间接种量pH值温度。K值大小可以评定其发酵产果胶酶的最优组合为A2B2C2D3，即培养时间为72 h、接种量为6%、发酵产酶温度为30 ℃、发酵产酶培养基初始pH值为6.5时为最优发酵方案，与单因素试验基本符合。由于正交试验中未设计该发酵方案，故需要3平行3重复的追加试验。根据正交试验得到的最佳优化组合进行追加试验，所测得的酶活为121.46 U/mL，比初始发酵酶活81.43 U/mL提高了1.49倍。试验最后对所得数据进行方差分析，比较各因素对产酶影响的显著性，见表4。由表4可知，在正交试验的4个因素中，只有培养时间对产酶影响达到显著水平。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.016.T004表4正交试验方差分析结果项目偏差平方和自由度F值临界值显著性培养时间665.736247.39719.000*接种量126.04828.97419.000发酵温度14.04621.00019.000初始pH值137.11629.76219.000误差14.0502注：1.“*”表示差异显著（P0.05）。2.发酵温度作为空白列。3结论本试验以果胶为唯一碳源的筛选培养基，在高效酒饼粉中筛选得到3株产果胶酶微生物，通过DNS法复筛选出果胶酶活最高的菌株JYJ；通过形态学观察和16S rDNA序列比对建系统进化树分析，鉴定其为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis）。通过4因素3水平进行培养条件优化，得到最优组合为：培养时间72 h、接种量6%、发酵产酶温度30 ℃、发酵产酶培养基初始pH值6.5；在此条件下，试验所测得的酶活为121.46 U/mL，比初始发酵酶活（81.43 U/mL）提高了1.49倍。