甘露寡糖是一种源自酵母细胞壁的抗原活性物质[1]，属于多糖，具有耐酸、耐高温、耐压的特性。甘露寡糖能够有效提高机体的免疫力[2]、促进动物体生长[3-4]、调节动物肠道健康[5]。甘露寡糖已经在家禽[6-7]、家畜[8-9]以及水产行业中广泛应用[9-10]。细胞壁中不同含量的甘露寡糖对动物体的作用程度不同，因此测定细胞壁中活性物质甘露寡糖的含量至关重要。测量的可能误差范围可通过不确定度表征，不确定度是与测量结果质量密切相关的参数，表示被测量值的分散性[11]。对饲料添加剂甘露寡糖（酵母细胞壁多糖）成分含量的检测结果进行不确定度评定，能够有效反映相应检测方法的准确度和置信度。本文采用我国农业行业标准《饲料原料 酿酒酵母细胞壁NY/T 3477—2019》规定的高效液相色谱法测定酵母细胞壁中的甘露寡糖[12]。为保证结果准确性，按照《检测和校准实验室能力认可准则》（CNAS—CL01—2018）[13]《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）[14]以及《化学分析中不确定度的评估指南》（GL06—2019）[15]中规定的方法和要求，对高效液相色谱法测定酵母细胞壁中甘露寡糖过程中引入的不确定度进行系统分析，以期掌握测量的影响因素。1材料与方法1.1试验材料水为一级水；Milli-Q去离子水发生器（Millipore公司）、氢氧化钠（优级纯，西陇科学股份有限公司）、盐酸（37%左右，西陇科学股份有限公司）、硫酸（优级纯，西陇科学股份有限公司）、甘露寡糖标准品（纯度≥99%，SIGMA公司）。甘露寡糖标准储备液（2 g/L）：称取甘露寡糖0.2 g，纯水定容至100 mL；氢氧化钠溶液（300 g/L）。1.2试剂与设备细胞壁试样由安琪酵母股份有限公司提供。带示差检测器高效液相色谱仪（Waters公司）；孔径0.45 µm微孔醋酸纤维素滤膜针头过滤器（安谱实验科技有限公司）；精度0.000 1 g分析天平（LS120A Precis公司）；HH-S12恒温水浴锅（常州国宇仪器制造有限公司）、EOAA-VM-B漩涡混合器（ANPEL公司）、YXQ-LS-50A立式灭菌锅（上海博讯实业有限公司）等。1.3试验方法1.3.1甘露寡糖标准系列溶液配制分别移取1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL甘露寡糖标准储备液于5个10 mL容量瓶，一级水稀释至刻度，摇匀。甘露寡糖浓度为200、400、600、800、1 000 µg/mL，0.45 µm微孔醋酸纤维素滤膜过滤。1.3.2色谱分析条件色谱柱：Aminex HPX-87H ion Exclusion（7.8 mm×300 mm BIO-RAD）。流动相：0.005 mol/L硫酸溶液，1 mL刻度吸管吸取0.55 mL的优级纯浓硫酸至5 L的烧杯，加入2 L一级水，搅拌均匀；进样量20 μL；流速0.6 mL/min；柱温65 ℃。1.3.3标准曲线的绘制参照仪器操作条件，将液相色谱仪调至最佳状态。分别进样 20 µL，测定甘露寡糖系列标准溶液，每个标准溶液重复测定3次，测得的峰面积均值分别对应甘露寡糖的浓度（µg/mL）绘制标准曲线，求得线性回归方程。1.3.4试样测定称取0.4 g细胞壁样品，放入20 mL耐热玻璃（带螺帽）的小试管中；加入6.0 mL盐酸（37%），30 ℃水浴45 min，转移至杜氏瓶。每瓶约加入100 mL一级水，拧紧瓶盖，120 ℃高压灭菌60 min；从灭菌锅中取出杜氏瓶，冷却至室温，调整pH值至7.0左右，定容至200 mL，使用0.45 µm微孔醋酸纤维素滤膜过滤，上机检测。将样品峰面积代入标准曲线中，求得试样溶液中甘露寡糖的浓度（µg/mL），计算其含量（%）。1.4测量数学模型甘露寡糖质量分数（X）计算公式为：X（%）=c×V×10-6m×100 (1)式中：c为与试样峰面积对应的由线性回归方程计算出的甘露寡糖的浓度（µg/mL）；m为试样的质量（g）；10-6为将浓度单位µg/mL换算为g/mL的换算系数；100为换算为100 g样品中含量的换算系数。2结果与分析2.1不确定度来源分析2.1.1样品称量引入的不确定度细胞壁试样0.4 g，每1次称量均随机变化和天平校准造成的不确定度。天平校准本身有两个不确定度的来源：灵敏性和线性。由于使用的是同一台天平，故灵敏度造成的不确定度忽略不计。2.1.2试样定容引入的不确定度试样定容至200 mL，溶液体积主要有3个方面的不确定度：校准容量品体积时造成的不确定度；平行测定定容时造成的不确定度，由于是同一个人操作，由此造成的不确定度忽略不计；由于检测样品时的温度与校准容量瓶时的温度不同而造成的不确定度。2.1.3试样重复测定引入的不确定度试样进行平行试验时，因水解程度问题所引入的不确定度。2.1.4标准曲线引入的不确定度包括由标准物质、标样定容、曲线拟合引起的不确定度。使用线性最小二乘法拟合曲线并计算样品中的甘露寡糖的含量，前提是假定横坐标的量的不确定度远小于纵坐标的量的不确定度。因此，浓度不确定度的计算仅与峰面积有关，与标准溶液的不确定度无关，与从同一溶液中逐次稀释不产生必然的相关性。不确定度的来源见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.024.F001图1不确定度来源2.2不确定度评定2.2.1细胞壁试样8次平行测定数据（见表1）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.024.T001表1细胞壁试样8次平行测定数据项目称样质量/g定容体积/mL峰面积/(µV·S)样品浓度/(µg/mL)样品含量/%10.426 72001 988 578518.86424.9520.413 92001 946 806507.96425.1830.395 72001 849 286482.52025.0240.397 12001 873 989488.96525.2750.392 62001 824 620476.08424.8860.397 32001 872 051488.45925.2370.415 72001 972 558514.68425.4180.410 62001 948 648508.44525.41平均值（X）0.406 22001 909 567498.24825.17注：样品含量的标准偏差S=∑i=1nXi-X¯2n-1=0.199%。2.2.2各不确定度分量量化2.2.2.1样品称量（m）的标准不确定度（urm）本试验所使用的万分之一天平SJ01-3，最大称样量Max=220 g，天平最小分度值d=0.1 mg，最大允许差e=10 d=10×0.1=1.0 mg。将置信水平按99%处理，按矩形分布，则称量引入的标准不确定度为：um=1.02/23=0.294 4 mg。因此，当细胞壁称样的平均质量为0.406 2 g时，称量的相对标准不确定度为：urm 壁=0.000 294 4/0.406 2=7.249×10-4。2.2.2.2样品定容的不确定度（urV）（1）温度的影响。量具在20 ℃校准，而实验室的温度在2 ℃间变动，该影响引起的不确定度可通过估算温度范围和体积膨胀系数计算，水的膨胀系数为2.1×10-4，按矩形分布计算，K=3。温度（u）=25×2×2.1×10-4/3=6.062×10-3 mL。（2）校准的影响。样品消化后使用200 mL的A级容量瓶定容，最大允许误差为±0.15 mL，按三角分布考虑K=6，则u容量瓶=0.15/6=6.124×10-2 mL。温度和校准带来的合成标准不确定度：uV=(6.062×10-3)2+(6.124×10-2)2=6.417×10-2 mL。相对标准不确定度：urV=6.417×10-2/200=3.208×10-4。2.2.2.3试样重复测定引入的相对标准不确定（urep）细胞壁重复性检测标准偏差：S=∑i=1nXi-X¯2n-1=0.199%(2)细胞壁重复性检测标准不确定度：u'rep=Sn=0.1998=7.036×10-2%。细胞壁相对标准不确定度：urep=7.036×10-225.17=2.795×10-3%。2.2.2.4标准曲线的标准不确定度（urS）该不确定度由两部分组成，分别为由标准溶液的浓度拟合的标准曲线求得C时产生的不确定度以及来自标准物质的不确定度及其配制标准溶液时产生的不确定度。标准曲线是通过对标准系列进行3次重复测定，测得其峰面积，标准溶液3次重复测定数据见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.024.T002表2标准溶液3次重复测定数据浓度/(μg/mL)峰面积1峰面积2峰面积3平均浓度̅=601.2 μg/mL平均峰面积Y¯=2 265 676200.4773 262773 187773 085400.81 526 2741 525 0721 529 054601.22 264 0072 265 2042 262 823801.63 009 1633 014 4443 012 6791 002.03 746 0023 751 2273 759 659µV·S15个标准系列的实验数据用最小二乘法拟合的校准曲线为：Y=3 714.337 0X+32 616.733 3。由测得的8个样品的峰面积得出样品的平均峰面积Y0=1 909 567（详细数据见表1）；将Y0代入公式得c0=505.326 µg/mL。标准曲线拟合数据见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.024.T003表3标准曲线拟合数据平均浓度/(µg/mL)浓度残差平方协方差均值峰面积均值面积残差平方均值200.4160 641598 193 251.8776 969.868 114 383 525.690400.840 160148 070 777.11 521 323.003 032 778 555.900601.2002 265 676.138 03 716 443.135801.640 16014 958 2407.73 010 029.273 09 087 100.9231 002.0160 641595 837 242.63 754 382.407 036 010 084.090注：标准溶液浓度残差的平方和为Sc=∑（ci-c¯）2=1 204 804.8；∑（ci-c¯）×（Yj-Y¯）×3=4 775 051 037.6；斜率b=∑（ci-c¯）2×（Yj-Y¯）×3/∑（ci-c¯）2=3 714.337 0；截距a=2 265 676.133-b×601.2=32 616.733 3；∑面积残差平方均值×3=287 927 129.200 4。浓度残差=(ci-c¯)2。协方差=(ci-c¯)×(Yj-Y¯)。由上可得标准溶液面积残差的标准偏差为：Sy=287 927 129.200 43×5-2=4 706.19。由标准曲线引入的标准不确定度为：uc0=Syb1p+1n×m+(c0-c̅)Sc=4 706.193 714.33718+13×5+(505.326-601.2)21 204 804.8=0.566 (3)式中：b为直线的斜率（3 714.337）；n为配制溶液的浓度数（5）；m为每个浓度的测量次数（3）；p为待测样品的测量次数（8）；c0为待测样品的浓度值（505.326 µg/mL）；c¯为5个标准溶液的浓度平均值（601.200 µg/mL）。c0的相对标准不确定度为：urC0=uc0c0=0.566505.326=0.001 12 (4)2.2.2.5标准物质的不确定度（urP）标准品甘露寡糖由SIGMA公司提供，具有溯源性。其纯度为99.0%。取其纯度（P）=（99.0%+100.0%）/2=99.5%，置信区间的半宽为（100.00%-99.50%）/2=0.25%，按照矩形分布考虑，甘露寡糖P引入的不确定度为：uP=0.002 53=0.001 443。相对标准不确定度为：urP= uPP=0.001 4430.995=0.000 145 0。2.2.2.6稀释标准系列所用量具引起的不确定度（见表4）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.11.024.T004表4标准系列配置过程量具标准引起的不确定度项目校准带来的不确定度温度带来的不确定度两因素不确定度合成相对标准不确定度（ur）最大允差/mL标准不确定度标准不确定度计算公式标准不确定度5 mL单标线移液管A级±0.0250.011 55×2×2.1×10-4/31.21×10-30.011 62.32×10-310 mL单标线容量瓶A级±0.020.011 510×2×2.1×10-4/32.42×10-30.011 81.18×10-3100 mL单标线容量瓶A级±0.100.057 7100×2×2.1×10-4/32.42×10-20.062 66.26×10-4由表4可知，每种仪器的不确定度主要有3个来源：仪器校准、使用时环境温度和玻璃仪器的重复性。所有由重复性引起的不确定度均在表1中考虑，此处不再考虑。由校准所引起的不确定度分量，查找每种量器对应的最大允差，假定其为矩形分布，取K=3，计算其不确定度。量具已在20 ℃校准，测量室环境温度为(20±2)℃，水的体积膨胀系数为2.1×10-4，估算温度变化所产生不确定度。由上述数据合成的相对标准不确定度为：ur(玻璃仪器)=ur12+ur22+ur32=2.68×10-3 (5)由标准物质、玻璃量具的校准和温度变化的标准不确定度分量合成标准溶液的相对标准不确定度为：ur(标准溶液)=urp2+ur(玻璃仪器)2=[0.000 145 02+(2.68×10-3)2]=2.684×10-3 (6)由以上不确定度分量合成的标准曲线的相对标准不确定度为：uS=urc02+ur(标准溶液)2=[0.001 252+(2.684×10-3)2]=0.002 96 (7)相对标准不确定度为：urS=0.002 96/505.326=5.86×10-6。2.3重复性试验引入的相对标准不确定度（urep）重复性检测标准偏差：S=∑i=1nXi-X¯2n-1=37.57(n=2)。重复性检测标准不确定度：urep=Sn=37.572=26.57 µg/mL。相对标准不确定度：urep=26.57505.326=5.26×10-2 µg/mL。2.4合成不确定度各不确定度分量相互独立，合成相对标准不确定度为： ucc=urm2+urV2+urS2+urep2=0.000 724 92+0.000 320 82+(5.86×10-6)2+0.052 62=0.052 6(8)合成标准不确定度为Uc=0.052 6×505.326=26.58 µg/mL。平均称样质量为0.406 2 g，定容至100 mL，合成标准不确定度为=26.58×100/0.406 2=6 543.57 µg/g=0.65%。2.5扩展不确定度取K=2，P=95%则U=0.65%×2=1.30%。2.6结果报告利用高效液相色谱仪，采用示差折光检测器测定的细胞壁的甘露寡糖的结果为：X=(25.17±1.30)%，K=2。3结论通过对高效液相色谱法（示差检测器）测定酵母细胞壁中甘露寡糖含量的不确定度评定，可以得出试样重复测定过程对测量结果的不确定度影响较大，标准曲线的制备、拟合标准曲线以及其他方面引入的不确定度几乎可忽略不计。因此，在试验过程中，一定要保证酵母细胞壁在酸水解过程中反应完全，并对仪器进行严格的检定与校正，才能够有效地降低其引入的不确定度，提高检测结果的准确性。