植物性饲料中60%~90%的磷元素以植酸磷的形式存在[1]。单胃动物自身不能分解植酸磷，造成磷元素的浪费。此外，植酸（盐）是饲料中的抗营养因子，通过螯合二价金属离子，降低动物对淀粉、蛋白质的分解利用率，影响动物生长[2]。植酸酶能够水解植酸（盐）从中释放无机磷，有效提高饲料中植酸磷的利用率，减少动物粪便中无机磷的排出量，从而降低磷对环境的污染和抗营养作用[3]。微生物植酸酶具有较宽的作用pH值、热稳定性以及较高的比活力[4]。目前，已从多种细菌、放线菌、真菌中获得植酸酶[5-8]。真菌植酸酶具有较高的活性和热稳定性，比细菌更适用于在饲料中应用。但是仅有限数量的真菌植酸酶被报道，且酶的生产成本较高[9]。 玉米浆是玉米湿磨工艺副产品，富含多种营养成分，因其积累的亚硫酸对动物体有潜在的危害，使其在养殖业的大规模应用受到限制[10]。玉米浆作为廉价的氮源、维生素或微量元素来源被用于抗生素、柠檬酸、漆酶等发酵产品研究中[11-13]。玉米粒经亚硫酸浸泡时分解的植酸保留于玉米浆中[10]。文章利用好食脉孢菌固态发酵玉米浆和麸皮混合物生产植酸酶，对培养基和培养条件进行优化，以期为植酸酶的低成本生产提供参考。1　材料与方法11　材料与试剂1.11　试验菌种好食脉孢菌（Neurospora sitophila）分离自发酵豆制品中，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.1836。1.12　试验试剂玉米浆购自齐齐哈尔市龙江阜丰生物科技有限公司；豆渣、麸皮购自齐齐哈尔农贸市场；醋糟购自齐齐哈尔市黑龙酿造有限责任公司；钼酸铵（分析纯）购自天津市元立化工有限公司；偏钒酸铵（分析纯）购自天津市科密欧化学试剂有限公司；硝酸（分析纯）购自北京化工厂；其他试剂（分析纯）购自天津市凯通化学试剂有限公司。1.13　培养基斜面培养基：PDA培养基具体配制方法见参考文献[14]。种子培养基：麸皮水3%（m/v）、蛋白胨1.5%（m/v）、初始pH值为5.5，具体配制方法参见文献[14]。12　试验方法1.21　菌种培养方法斜面培养：将4 ℃保存的好食脉孢菌菌株挑取至PDA斜面上，28 ℃培养3~5 d。 种子培养：250 mL三角瓶中装50 mL培养基，121 ℃灭菌30 min，冷却后加入1 mL孢子悬浮液（107个孢子/mL），28 ℃、150 r/min振荡培养15 h。1.22　碳源对植酸酶活力的影响以玉米浆作为培养基的氮源，分别以干豆渣、麸皮、干醋糟作为碳源，在250 mL三角瓶中加入1 mL玉米浆、8 g上述碳源和21 mL蒸馏水，培养基初始pH值4.35，121 ℃灭菌30 min，按10%（v/m）接种量接入好食脉孢菌种子培养液（v/m），28 ℃恒温培养72 h后测定酶活力。1.23　玉米浆浓度对植酸酶活力的影响调整培养基中玉米浆的浓度分别为20、25、30、35、40 g/L，加入量分别为0.60、0.75、0.90、1.05、1.20 mL，再加入8 g麸皮和21.40、21.25、21.10、20.95、20.80 mL蒸馏水，培养基初始pH值4.35，121 ℃灭菌30 min，按10%（v/m）接种量接入好食脉孢菌种子培养液，28 ℃恒温培养72 h后测定酶活力。1.24　培养条件对植酸酶活力的影响培养基由0.75 mL玉米浆、8 g麸皮和21.25 mL蒸馏水组成，121 ℃灭菌30 min，接种后在一定温度下培养，分别研究如下培养条件对植酸酶活力的影响：培养基初始pH值为3.5、4.5、5.5、6.5、7.5；培养温度23、28、33、38 ℃；培养时间48、72、96、120、144 h；接种量5%、10%、15%（v/m），均采用已优化的条件进行其他条件的优化。1.25　正交试验优化条件在单因素的试验基础上，选择玉米浆浓度（20、25、30 g/L）、发酵温度（25、28、31 ℃）、接种量（8%、10%、12%）3个因素进行L9（34）正交试验，进一步优化植酸酶固态发酵条件。1.26　粗酶液的制备在培养结束后，向培养基中加入100 mL蒸馏水，28 ℃、180 r/min摇床中浸提4 h，然后经过滤、离心（4 ℃、10 000 r/min离心10 min）得到植酸酶粗酶液。1.27　植酸酶活力的测定植酸酶活力的测定参考文献[15]，磷含量计算公式：Y=38.398 0X+0.0676，R2=0.998 3。 酶活力定义：在37 ℃、pH值5.5的条件下，每分钟释放1 μmol的无机磷定义为一个酶活力单位（U/g）。1.28　数据统计与分析试验数据采用Microsoft Excel 2003和SPSS 17.0进行单因素方差分析（One-way ANOVA），采用Duncan氏法进行多重比较，P＜0.05表示差异显著，P0.05表示差异不显著。2结果与分析21　碳源对植酸酶活力的影响（见图1）由图1可知，麸皮为碳源时植酸酶活力显著高于另外2种碳源（P＜0.05），酶活力可以达到26.24 U/g。麸皮还可增加培养基的孔隙率，使氧气易于在培养基中流通以及释放生物热，促进菌体生长代谢。豆渣作为碳源，培养基较黏稠，使氧气流通较差，菌体生长代谢受抑制，酶活力较低；醋糟作为碳源可用于好食脉孢菌植酸酶的固态发酵，但是由于醋糟和玉米浆均呈现酸性，使培养环境pH值偏低，不适宜好食脉孢菌生长，因而酶活力较低。通过试验确定麸皮为好食脉孢菌产植酸酶的碳源。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.01.017.F001图1碳源对植酸酶活力的影响注：图中标注不同小写字母表示差异显著（P0.05）；下图同。22　玉米浆浓度对植酸酶活力的影响（见图2）玉米浆是丰富的营养素来源，不仅可以作为微生物氮源，而且还包含细胞生长所必需的矿物质和辅助因子[16]。由图2可知，植酸酶活力随玉米浆浓度增加而增大，在浓度为25 g/L时达到最大，继续增加玉米浆浓度，酶活力呈下降趋势。高浓度的玉米浆可能引起培养基中碳氮比的变化，进而影响细胞生长和代谢产物的产生。此外，较高浓度的玉米浆中可能存在某些抑制成分，而对植酸酶的合成产生负面影响[17]。玉米浆浓度为25 g/L的植酸酶活力显著高于其他浓度（P0.05），因此，确定玉米浆最佳浓度为25 g/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.01.017.F002图2玉米浆浓度对植酸酶活力影响23　培养基初始pH值对植酸酶活力的影响（见图3）培养基pH值会影响酶促反应过程以及各种成分跨细胞膜的运输，从而影响细胞生长和产物形成，大多数丝状真菌的最适生长pH值为3.6~6.0，但是菌体最适生长pH值和最适产酶pH值往往不一致[18]。由图3可知，在pH值5.5时植酸酶活力达到最大值77.64 U/g，显著高于其他pH值时的酶活力（P0.05）。因此，确定培养基初始pH值条件为5.5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.01.017.F003图3培养基初始pH对植酸酶活力影响24　培养温度对植酸酶活力的影响（见图4）温度是影响固态发酵效率最重要的因素，低培养温度会使产物合成周期延长；较高的温度可能导致蛋白质的变性而影响生长和产物合成[19]。由图4可知，在23~38 ℃范围内好食脉孢菌均可产植酸酶，最适产酶温度为28 ℃。该产酶温度低于黑腐质霉[9]、米曲霉GE1[20]和嗜热黑曲霉[21]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.01.017.F004图4培养温度对植酸酶活力影响25　发酵时间对植酸酶活力的影响（见图5）植酸酶的合成受培养时间的影响，培养时间的不同导致菌体所产酶活力不同。由图5可知，植酸酶活力在72 h时达到最大，且显著高于其他培养时间的植酸酶活力（P0.05）。随着培养时间的继续延长，植酸酶的活力逐渐降低。好食脉孢菌的产酶周期较短，A. oryzae[21]和无花果曲霉[22]在培养至96 h时植酸酶活性达到最高，而在黑曲霉Phy-A[23]菌株中植酸酶的产量在培养120 h后达到最高。好食脉孢菌较短的产酶周期更适于缩短工业生产周期。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.01.017.F005图5培养时间对植酸酶活力影响26　接种量对植酸酶活力的影响（见图6）霉菌固态发酵可以采用孢子接种和营养细胞接种，孢子接种往往需要较大的接种量，且孢子是休眠体，需要适当的条件才能萌发，因此，生产周期长。采用营养细胞接种时，由于必需酶在种子培养阶段已经合成，有利于缩短发酵周期[18]。固态发酵时需要适宜的接种量，接种量过小会导致菌丝体生物量低，而接种量过大会产生不必要的真菌生长和养分消耗，导致真菌细胞养分匮乏并在发酵阶段停止生长[24]。由图6可知，接种量为10%时的植酸酶活力显著高于其他2种接种量的酶活力（P＜0.05）。接种量为5%时，菌体不佳，导致酶活力较低；而接种量为15%时，菌体生物量快速增加，导致对营养素和氧气的竞争加剧，使酶活力降低，与Gaind等[25]的报道一致。因此，确定最佳接种量为10%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.01.017.F006图6接种量对植酸酶活力影响27　正交试验设计优化植酸酶生产条件（见表1、表2）采用正交试验对玉米浆浓度、培养温度和接种量进行进一步优化，每个因素设置3个水平，采用L9（34）正交设计表进行试验，直观分析结果见表1，方差分析见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.01.017.T001表1L9（34）试验结果水平玉米浆浓度培养温度接种量误差列植酸酶活力/(U/g)1111154.432122261.753133352.444213370.895221181.316232266.587312246.218323348.159331147.43k156.2157.1856.39k272.9363.7460.02k347.2655.4859.99R25.668.253.6410.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.01.017.T002表2方差分析因素偏差平方和自由度F值F0.05值玉米浆浓度1 018.148241.557*19.000培养温度114.01824.65419.000接种量26.18721.06919.000误差24.5002校正后总计1 182.8538注：*表示显著性差异（P0.05）。由表1可知，通过比较均值k可知好食脉孢菌固态发酵产植酸酶的最优组合为A2B2C2，即玉米浆浓度25 g/L、培养温度28 ℃、接种量10%。根据极差值判断主次顺序依次为R1R2R3，即玉米浆浓度培养温度接种量。由表2可知，培养基中玉米浆浓度显著影响植酸酶活性（P＜0.05），培养温度和接种量对植酸酶的活性影响不显著（P＞0.05）。28　验证试验根据单因素和正交试验优化结果，进行了固态发酵试验验证，好食脉孢菌固态发酵产植酸酶的发酵条件为：250 mL三角瓶中的培养基由25 g/L玉米浆浓度0.75 mL、8 g麸皮和21.25 mL蒸馏水组成，培养基初始pH值5.5，接种量10%，在28 ℃条件培养72 h，获得的植酸酶活力为79.49 U/g。验证试验的相对偏差为1.03（n=3），说明该工艺条件的稳定性和重复性良好。好食脉孢菌发酵玉米浆和麸皮产植酸酶的活力大约是黑腐质霉产植酸酶的活力（48.28 U/g）的1.6倍[9]。3结论以农产品加工下脚料玉米浆和麸皮为主要原料，利用好食脉孢菌固态发酵生产植酸酶，确定固态发酵培养基由25 g/L玉米浆浓度0.75 mL、8 g麸皮和21.25 mL蒸馏水组成，培养基初始pH值5.5，接种量10%、28 ℃条件培养72 h时，获得的植酸酶活力为79.49 U/g，较优化（26.24 U/g）前提高3.03倍。以富含蛋白质的玉米浆和富含淀粉的麸皮为原料用于植酸酶的生产，不仅有助于诱导酶的合成，且原料来源广泛、成本低廉。同时，采用FDA认证[26]的安全菌种好食脉孢菌作为生产菌种，提高了植酸酶的安全性，具有进一步将其开发为食品或饲料用酶制剂的前景。