沸石常作为添加剂预混物的载体和稀释剂，不易受潮，与含有结晶水的无机盐微量成分混合能吸附其中的水分，增强饲料的流动性[1]。沸石表面粗糙、多孔，具有较强的携载能力，不但能使物料均匀地吸附在表面，而且能吸附到孔穴和通道内，提高物料的可利用性，改善混合的均匀性，抑制某些病原菌生长发育的可能性，从而维持肠道正常功能[2]。沸石粉在机体内还可能具有多种生物酶的催化作用，能促进机体对有机饲料的吸收，提高各种饲料的营养价值[3]。植酸酶主要作用是破坏植酸对矿物元素的亲和力，增加矿物元素的营养效价。因其能将磷酸残基从饲料植酸上水解下来，降低机体对外源无机磷的需求，从而减少磷的排放[4]。植酸酶对光、热较敏感。在饲料生产过程中，由于粉碎、预混、制粒以及其他添加剂的影响都可能降低酶活性，导致植酸酶的作用效果降低。为减少植酸酶易受环境影响的弊端，本试验选择沸石粉为载体，通过振荡吸附作用制备沸石粉/植酸酶复合物，探讨沸石粉/植酸酶复合物的稳定性，为植酸酶的高效利用提供参考。1材料与方法1.1原料、试剂及仪器设备沸石粉购自江苏华正矿产品有限公司；植酸酶（活性50 U/mg）购自合肥巴斯夫生物科技有限公司；植酸钠购自合肥巴斯夫生物科技有限公司；乙酸钠、氨水、牛血清蛋白、曲拉通X-100、乙酸、硝酸、碘化汞、碘化钾、钼酸铵、偏钒酸铵、磷酸、盐酸、硫酸、考马斯亮蓝G250、95%乙醇、柠檬酸、磷酸氢二钠等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。UV-2100pc紫外可见分光光度计购自上海丹鼎国际贸易有限公司；防水型笔试pH/℃测定仪购自杭州汇尔仪器设备有限公司；88-1大功率恒温磁力搅拌器购自苏州国华仪器有限公司；THZ-22台式恒温振荡器购自太仓文尔惠金仪器有限公司；高速离心机购自深圳市亿天净化技术有限公司；高速分散机购自上海沐轩实业有限公司；D8 Discover X射线粉末衍射仪购自德国布鲁克（AXS）公司；Nicolet 5700 红外分光光度计购自北京尼高力天光科贸有限公司。1.2试验方法1.2.1沸石粉预处理沸石粉纯化：取沸石粉适量，过200目筛，加水浸泡，制成约20%~25%的悬浊液，高速打浆分散（每隔10 min打浆1次）30 min，将浆料取出，静置沉降3 h，去掉上层清液，10 000 r/min离心15 min，烘干备用。沸石粉的分散：取3.0 g沸石粉，加入至80 mL去离子水中制成悬浊液，置于探头式超声仪中对沸石粉的悬浊液进行超声分散。将超声后的悬浊液转移至100 mL循环式冷却杯，超声探头固定于沸石粉悬浊液页面2 cm处，不同功率下超声一定时间，以80%振幅稳定输入6 000 J能量，超声过程中不间断向循环式冷却杯中通过冷水，使得产生温度维持在20 ℃，静置12 h，去掉上层清液和下层大颗粒沉淀，烘干备用[5]。重液离心分离：取一定体积比重为2.0~2.2的杜列重液（碘化汞-碘化钾溶液）倒入分液漏斗中，然后将上述纯化沸石粉以甲醇浸润后缓缓倒入，用玻璃棒搅拌，2 000 r/min离心分离12~14 h，取相对密度为2.0~2.2的沸石粉，烘干备用。1.2.2植酸酶的提取取50 g饲用植酸酶加500 mL乙酸缓冲液B（分别称取20.52 g无水乙酸钠、0.4 g曲拉通X-100、0.5 g牛血清蛋白于1 000 mL烧杯中，加入900 mL左右的去离子水溶解，用乙酸调节pH值至5.5±0.01，转移至1 000 mL容量瓶中，用去离子水定容）混匀，转至1 000 mL烧杯中，加入计算量的硫酸铵粉末，使硫酸铵饱和度在80%左右，磁力搅拌器搅拌60 min，4 200 r/min离心30 min，去掉下层残留不溶物，将沉淀溶解于100 mL pH值 5.5的乙酸缓冲液中B，分取10 mL在4 ℃下透析，除盐备用[6]。1.2.3离子交换纤维素层析取上述透析后的溶液，上柱洗脱，洗脱液为1.0 mol/L的NaCl和pH值5.5的乙酸钠缓冲液B。称取一定量的AEDE-52（二乙胺基乙基）5 g，置于500 mL蒸馏水中，浸泡1 h，除去上层细粒杂质。加入0.5 mol/L的NaOH溶液（两者比例为1∶15）中，搅拌，静置30 min，抽滤，用蒸馏水洗涤至pH值为中性。以0.5 mol/L的HCl溶液重复上述操作，最后以0.5 mol/L的NaOH溶液进行处理，洗涤至中性。洗脱采用乙酸钠缓冲液，上样量为2.0 mL，流速为2 mL/min。1.3标准曲线的绘制1.3.1植酸酶标准曲线（见图1）称取0.25 g植酸酶标准品（精确至0.000 1 g）于烧杯中，加入pH值5.5的乙酸缓冲液B溶解，移至25 mL容量瓶中，定容至刻度。取1 mL植酸酶标准母液，按照倍比稀释法稀释至5.000 00、2.500 00、1.250 00、0.625 00、0.312 50、0.156 25 mg/mL，各取1 mL，加入考马斯亮蓝G250染色剂4 mL，混匀后放置10 min，测595 nm处吸光度[7]，以不加植酸酶为空白对照。植酸酶溶液浓度为横坐标，A595 nm为纵坐标，绘制标准曲线。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.01.018.F001图1植酸酶标准曲线1.3.2磷标准曲线取适量KH2PO4，置于120 ℃烘箱中干燥2~3 h，干燥后，精密称取0.680 4 g，加适量乙酸钠缓冲液A（取20.52 g无水乙酸钠加入适量去离子水溶解，采用乙酸调节pH值至5.5±0.01，用去离子水定容至1 000 mL）溶解，转移至100 mL容量瓶中，定容至刻度，浓度为50 mmol/L。量取1.0 mL KH2PO4母液，取乙酸缓冲液B按照倍比稀释法稀释至25.000 0、12.500 0、6.250 0、3.125 0、1.562 5 mmol/L。另取试管，加入0.9 mL乙酸钠缓冲液A，加入0.1 mL待测KH2PO4溶液，混匀，于37 ℃水浴预热5 min，取出，加入2 mL植酸钠溶液，于37 ℃水浴反应30 min，加入2 mL显色剂，测415 nm处吸光度。以磷的浓度为横坐标，A415 nm为纵坐标。重新配置显色剂时，需重测磷的标准曲线以减少测量误差。本试验中，每次新配置显色剂时需重测磷的标准曲线，所测磷的标准曲线相关系数均在0.999 0以上，呈现良好的线性关系。1.4复合试验取30 mL植酸酶溶液和0.2 g沸石粉放置于锥形瓶中，于恒温振荡仪中振荡120 min，4 000 r/min离心30 min，获取沉淀并收集上清液。取上清液1 mL，按照考马斯亮蓝G250染色法，测上清液中植酸酶蛋白含量。另将离心管沉淀部分取出，置于冷冻干燥机种干燥24 h，研磨，过200目筛，备用。1.5样品表征1.5.1XRD分析将沸石粉、沸石粉/植酸酶复合物分别平铺于X射线粉末衍射仪测试板上。分析条件为：C靶Kα辐射，管电压40 kV，电流40 mA，扫描范围5~80°，扫描速度0.2°/min，进行X射线衍射，得到XRD谱图。1.5.2FTIR分析将沸石粉、沸石粉/植酸酶复合物分别于溴化钾混匀压片，在400~4 000 nm范围内进行红外扫描，得到检测红外光谱。1.6复合物稳定性试验金属阳离子的影响：取适量沸石粉/植酸酶复合物，分别加入计算量的金属阳离子溶液，测量植酸酶活性。温度的影响：测暴露在70 ℃下饲用植酸酶和沸石粉/植酸酶复合物的酶活性。pH值适应性：畜禽消化器官的体液pH值在3~7左右，测在此pH值条件下饲用植酸酶与沸石粉/植酸酶复合物酶活性。蛋白酶水解耐受性：体外采用胃蛋白酶模拟胃环境中的蛋白酶，酶解温度为37 ℃，测自由植酸酶和沸石粉-植酸酶复合物在2、6、24 h后的酶活性。植酸酶活性测定方法：参照GB/T 18634—2009。2结果与分析2.1XRD分析（见图2）由图2可知，沸石粉和沸石粉/植酸酶的XRD图谱在2θ为20.871°、20.874°处出现较强的吸收峰，是沸石粉特征衍射峰，层间距没有发生改变，表明植酸酶吸附在沸石粉并没有引起沸石粉结构的改变，可能是植酸酶蛋白分子过大，无法插入到内部，吸附只发生在沸石粉表面。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.01.018.F002图2沸石粉和沸石粉/植酸酶复合物的X射线衍射图2.2FTIR分析（见图3）由图3可知，沸石粉与沸石粉/植酸酶的FTIR谱图在400~1 200 cm-1有吸收峰，是沸石粉的特定结构吸收峰[8]，789 cm-1处是T-O对称伸缩震动吸收峰；507 cm-1处是O-Si-O和O-Al-O角变形后的吸收峰，特征峰强度略有减弱。在1 426 cm-1和1 560 cm-1处出现新的红外吸收峰为酰胺特征吸收峰。植酸酶可以成功吸附在沸石粉上。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.01.018.F003图3沸石粉和沸石粉/植酸酶复合物FTIR图谱2.3沸石粉/植酸酶复合物稳定性分析2.3.1金属阳离子对吸附和植酸酶酶活的影响（见图4）由图4可知，金属阳离子对沸石粉吸附植酸酶的吸附量影响与植酸酶的活性影响各不相同。对于吸附量来说，沸石粉对阳离子是具有一定的吸附作用[9-10]，二价阳离子较一价阳离子正电荷增加，与沸石粉表面的负电荷的结合能力随之增加，导致沸石粉对饲用植酸酶的吸附量相应减少；K+与Na+虽然价态相同，但是由于K+水合半径较大，所占吸附点相应增多，导致对沸石粉吸附植酸酶的吸附量减少。Na+和Ga2+可提高酶的活性，Zn2+对植酸酶活性具有较强的抑制作用，在低浓度时Cu2+对植酸酶酶活无影响，浓度增加至0.5 mol/L后对植酸酶抑制作用增强。分析其原因主要是有些阳离子可以促进植酸酶与底物的结合，增加植酸酶活性，而有的阳离子会竞争性地与底物结合或者引起植酸酶担保构象的改变，从而降低植酸酶与底物的结合速率，导致酶活降低。金属阳离子对沸石粉/植酸酶复合物酶活的影响见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.01.018.F004图4金属阳离子对吸附和植酸酶酶活的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.01.018.T001表1金属阳离子对沸石粉/植酸酶复合物酶活的影响 单位：%样品沸石粉/植酸酶复合物饲用植酸酶Zn2+43.6535.84Cu2+68.9962.11由表1可知，相比提取液的植酸酶，两种离子对复合物酶活性的影响较饲用植酸酶小。原因可能是植酸酶吸附到沸石粉后，金属阳离子首先选择与沸石粉表面的负电荷的相互作用，减少对植酸酶的影响。2.3.2温度对吸附率和植酸酶酶活的影响（见图5）由图5可知，将复合物的制备设置在不同的温度下进行，同时将饲用植酸酶以对照组置于同等温度条件下发现，温度对沸石粉吸附植酸酶和植酸酶活性均有影响。随着温度的升高，沸石粉对植酸酶的吸附量随之增加，40~50 ℃后增加趋势趋于平缓，55 ℃吸附率略有下降；对于植酸酶活性，在40 ℃时植酸酶活性出现最大值，此时植酸酶酶活受温度影响最小。综合考虑，适宜在40 ℃条件下制备沸石粉/植酸酶复合物。温度对沸石粉/植酸酶复合物酶活的影响见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.01.018.F005图5温度对吸附和相对酶活的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.01.018.T002表2温度对沸石粉/植酸酶复合物酶活的影响时间/min沸石粉/植酸酶复合物饲用植酸酶3082.3580.8912042.8225.5824034.5811.47%由表2可知，在70 ℃下暴露30 min后，复合物和饲用植酸酶均保留较高的相对酶活；暴露4 h后，植酸酶相对酶活仅剩11.47%，而复合物仍保留34.58%的相对酶活。其原因主要是高温环境使植酸酶的氨基酸结构发生改变，导致植酸酶失活，植酸酶吸附到沸石粉上后对植酸酶产生一定的保护作用。2.3.3沸石粉/植酸酶复合物对pH值适应性（见图6）畜禽消化器官的pH值一般在3~7之间。由图6可知，复合物的最适介质pH值为5，在畜禽消化器官内可充分发挥其催化水解植酸磷的作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.01.018.F006图6沸石粉/植酸酶复合物对pH值适应性2.3.4沸石粉/植酸酶复合物胃蛋白酶水解耐受性（见表3）由表3可知，经胃蛋白酶水解2 h后，沸石粉/植酸酶复合物与饲用植酸酶酶活均在70%以上，水解24 h后，沸石粉/植酸酶复合物仍保留49.22%的酶活性，而饲用植酸酶的相对酶活只剩6.04%，沸石粉/植酸酶复合物的胃蛋白酶水解耐受性较自由植酸酶显著提高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.01.018.T003表3沸石粉/植酸酶复合物胃蛋白酶水解耐受性 单位：%时间/h沸石粉/植酸酶复合物饲用植酸酶278.8274.66668.2345.232449.226.043讨论本试验结果表明，随着温度的升高，沸石粉对植酸酶的吸附量增加，植酸酶在温度为35~40 ℃之间酶活性较高。低温不利于沸石粉吸附植酸酶，其酶活也会受到一定的抑制作用。XRD和FTIR结果显示，植酸酶可吸附在沸石粉表面，不会改变沸石粉结构。与饲用植酸酶相比，沸石粉/植酸酶复合物的温度耐受性相对酶活提高23.11%，蛋白酶水解耐受性相对酶活提高43.18%，pH值为5，相对酶活94.30%。本试验结果表明：温度耐受性相对酶活16.15%，蛋白酶耐受性相对酶活为18.81%，适宜的介质pH值均为5，相对酶活分别为76.80%。张闻中等[11]研究表明：温度耐受性相对酶活22.00%，蛋白酶耐受性相对酶活为41.10%，适宜的介质pH值均为4.0~4.5，对酶活分别为68.00%。金属阳离子对复合物的影响中，相比酶提取液中的植酸酶，植酸酶吸附到沸石粉后，金属阳离子对植酸酶活性的影响减小，相对酶活增加。4结论将植酸酶吸附至沸石粉表面对植酸酶具有保护作用，植酸酶的催化水解植酸磷活性明显高于单纯的植酸酶。