鬼针草（Bidens Pilosa L.）为菊科鬼针草属的一年生草本植物[1]。鬼针草属药材资源丰富，我国常见9个种，主要分布在华东、华北、东北等地区[2]。鬼针草全草可入药，有解毒清热、活血散瘀的功效。现代药理学研究表明，鬼针草具有抗癌、抗高血糖、高血压、免疫调节和抗炎等作用[3-4]。鬼针草化学成分复杂，主要成分包括黄酮类、烯炔类、挥发油、生物碱、氨基酸等[5-6]。随着我国饲料添加剂全面禁抗的实施，因价格低廉，将鬼针草开发成具有促生长、抗菌等作用的中草药饲料添加剂具有巨大的前景。目前鬼针草黄酮类成分的提取工艺主要为乙醇回流法[7-8]，但提取效率较低。本研究采用超声辅助回流提取法对鬼针草黄酮类成分提取工艺进行优化，并考察其抗菌作用，为鬼针草作为中草药饲料添加剂的进一步开发提供参考。1材料与方法1.1试验仪器BSA224S-CW分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）、SYU-22-600DT超声波清洗机（郑州生元仪器有限公司）、RE-2000B旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）、SHZ-95B循环水式多用真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）、Varioskan多功能酶标仪（Thermo Scientific公司）、LDZM-60KCS立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）、JH-SCB超净工作台（上海鸿都电子科技有限公司）、SPX-300BSH生化培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）、DHG-9423A电热鼓风干燥器（上海新苗医疗器械制造有限公司）。1.2药材与试剂鬼针草采集于河南省焦作市太行山，由河南牧业经济学院中药学教研室鉴定为菊科鬼针草属的鬼针草（Bidens Pilosa L.），8月份割取地上部分，晒干，备用。金黄色葡萄球菌临床分离株由河南牧业经济学院动物医药学院药理学实验室提供。芦丁标准品（批号MUST-19010202，纯度98%）购自上海士锋生物科技有限公司；硼砂购自天津市永大化学试剂有限公司；亚硝酸钠购自天津市风船化学试剂科技有限公司；硝酸铝购自常州市海拓实验仪器有限公司；NB肉汤培养基购自北京奥博星生物技术有限公司；2,3,5-三苯基氯化四氮唑购自北京索莱宝科技有限公司。1.3试验方法1.3.1鬼针草总黄酮提取方法超声法：称取鬼针草药材粉末（过2号筛）200 g，加入10倍量75%乙醇，超声提取2次，每次30 min，滤过，减压浓缩，干燥，称重。加热回流法：称取200 g鬼针草药材粉末（过2号筛），置于圆底烧瓶中，加入10倍量75%乙醇，85 ℃水浴加热回流提取2次，每次30 min，滤过，减压浓缩，干燥，称重。超声辅助回流提取法：称取鬼针草药材粉末（过2号筛）200 g，置于圆底烧瓶中，加入10倍量75%乙醇，超声提取30 min，85 ℃水浴加热回流提取30 min，滤过，减压浓缩，干燥，称重。碱溶酸沉提取法：称取鬼针草药材粉末（过2号筛）200 g，加入10倍量0.4%硼砂水，用饱和石灰水调节液体pH值为10.0，95 ℃提取1 h，离心取上清液用浓盐酸调节pH值为3.0，静置24 h，抽滤，沉淀物用纯化水洗至中性，干燥，称重。每种方法进行3次平行试验。计算鬼针草总黄酮提取物得率。总黄酮提取得率(%)=m/M×100 (1)式中：m为鬼针草总黄酮提取物质量（g）；M为鬼针草药材粉末质量（g）。1.3.2正交设计优化鬼针草黄酮提取工艺采用正交设计对总黄酮提取得率最高的提取方法进行工艺参数优化。每组各称取鬼针草干燥药材100 g。选取乙醇浓度（A）、提取温度（B）、超声时间（C）、回流时间（D）为主要考察因素，采用L9（34）正交表进行试验，各因素水平表见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.01.001.T001表1超声辅助回流提取正交试验的因素与水平水平A乙醇浓度/%B提取温度/℃C超声时间/minD回流时间/min1509030402704010603906520251.3.3黄酮含量测定1.3.3.1标准曲线的建立采用亚硝酸钠-硝酸铝显色法测定黄酮含量[9]。制备0.206 g/L的芦丁对照品溶液，在510 nm波长下测定不同浓度芦丁标准溶液的吸光度，以吸光度A为纵坐标，芦丁浓度C为横坐标绘制吸光度-浓度标准曲线，得到芦丁标准曲线为：Y=4.588 2X-0.004 9（R²=0.998 1），芦丁在0.008 24~0.049 44 g/L范围内线性关系良好。1.3.3.2鬼针草提取物的黄酮含量测定取正交设计每个组合的提取物各2.5 g，用70%乙醇溶解于5 mL离心管中，滤纸过滤，精密量取0.5 mL提取液，置于25 mL容量瓶中，用70%乙醇补充至5 mL，加入5%NaNO2溶液1 mL，摇匀，放置6 min；10%Al(NO3)3溶液1 mL，摇匀，放置6 min；4% NaOH溶液10 mL，混匀，用70%乙醇定容，摇匀，放置15 min，吸取50 μL于96孔板中，再加入70%乙醇150 μL，混匀。在510 nm波长处测定其吸光度，以不加提取液的样品为空白，平行测定３次，取平均值。黄酮含量(%)=(C×V1×V2×V3)/1 000M×V2’×V3’ (2)式中：C为标准曲线上查出来的浓度（g/L）；V1为96孔板每孔的定容体积（mL），V2为容量瓶体积（mL）；V3为离心管体积（mL）；V2'为从容量瓶取液的体积（mL）；V3'为从离心管取液的体积（mL）；M为每组提取物取用量（g）。黄酮收量(g)=正交试验称取的药材质量(g)×提取得率×黄酮含量 (3)1.4体外抑菌试验1.4.1菌液配制将金黄色葡萄球菌接种于新鲜NB肉汤培养基中，于37 ℃恒温振荡培养箱中培养16~18 h。采用0.5号麦氏比浊管调整细菌浓度为1.5×108 CFU/mL，再稀释至1.0×106~1.0×107 CFU/mL的菌悬液。1.4.2琼脂打孔法测定提取物的抑菌圈分别称取正交试验组的9组总黄酮提取物各2.5 g，用70%乙醇定容至5 mL，过滤，取上清液，即为提取物药液（0.5 g/mL）。吸取50 μL金黄色葡萄球菌菌液均匀涂布于NB琼脂培养基上，在每个培养基上用直径6 mm的无菌打孔器打4个孔，每组提取物药液做3个平行试验，每孔分别加入鬼针草黄酮提取物药液50 μL，另外一个孔作为空白对照，加入空白溶剂。将培养皿置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，观察结果，测量抑菌圈的直径并记录。分别测定正交试验9组提取物的抑菌圈直径。1.4.3最低抑菌浓度（MIC）的测定参考CLSI标准文件，采用微量倍比稀释法测定[10]。取96孔板，加入含有红四氮唑的NB培养液100 μL，在每行第一孔中加入鬼针草提取物药液100 μL，混匀后于第1孔吸取100 μL移至第2孔中，以此类推至第10孔，弃去多余的100 μL，然后加入菌液100 μL，混匀。第11孔不加提取液作为阳性空白对照，第12孔不加提取液和菌液作为阴性空白对照。将培养板置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h后观察细菌生长情况，测定其最小抑菌浓度。以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。选取正交试验提取物中高黄酮组和低黄酮组，分别进行体外MIC的测定。1.4.4最小杀菌浓度（MBC）的测定确定MIC后，参考CLSI标准文件，将MIC孔前3~5孔的培养液接种于NB琼脂平板培养基上，置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h。采用活菌计数法检查琼脂平板上的菌落数，平均数小于5 CFU/mL的药物浓度则为该药物的MBC，平行试验3次，取平均值。选取正交试验提取物中高黄酮组和低黄酮组，分别进行体外MBC的测定。2结果与分析2.1鬼针草不同提取方法的提取率（见表2）由表2可知，超声辅助回流提取法的提取得率高于其他3种方法。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.01.001.T002表2鬼针草不同提取方法的提取率提取方法药材用量/g总黄酮得率/%超声提取法（UL）20014.44加热回流提取法(RE)20016.04碱溶酸沉提取法（ASAP）2002.12超声辅助回流提取法（U-A）20021.312.2正交设计优化超声辅助乙醇提取工艺L9（34）正交设计试验结果见表3。由表3可知，以黄酮收量作为考察指标，可以看出工艺7（A3B1C3D2）的收量最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.01.001.T003表3L9（34）正交试验结果组号A/%B/℃C/minD/min组合提取得率/%总黄酮含量/%黄酮收量/g150903040A1B1C1D131.145.561.73250401060A1B2C2D219.146.171.18350652025A1B3C3D328.176.821.92470901025A2B1C2D329.025.931.72570402040A2B2C3D120.438.521.74670653060A2B3C1D223.645.291.25790902060A3B1C3D222.488.591.93890403025A3B2C1D38.294.220.35990651040A3B3C2D111.9110.831.29K11.6101.7931.1101.587K21.5701.0901.3971.453K31.1901.4871.8631.330R0.4200.7030.7530.257因素主次CBAD最佳组合A1B1C3D1由表3可知，各因素对鬼针草总黄酮提取的影响顺序为超声时间提取温度乙醇浓度回流时间。最佳提取工艺为A1B1C3D1，即乙醇浓度为50%、回流提取温度为90 ℃、超声时间为20 min、回流提取时间为40 min。以极差分析法确定的最佳提取工艺A1B1C3D1和直观分析法的最佳工艺A3B1C3D2进行3次平行验证，其中A1B1C3D1平均提取得率为35.59%，总黄酮平均含量为5.54%，提取物中总黄酮平均达1.96 g，RSD=0.81%，优于其他正交组合，表明该工艺稳定可行。与A3B1C3D2相比，该工艺成本稍低，因此确定A1B1C3D1为最佳工艺。2.3鬼针草提取物体外抑菌试验结果2.3.1鬼针草正交试验各组提取物的抑菌活性 （见表4）由表4可知，鬼针草正交试验的各组提取物对金黄色葡萄球菌均有抑制作用（d10 mm）。但各组提取物的抑菌圈直径差别并不大。组合7的抑菌圈最大，组合2的抑菌圈最小。二者抑菌圈大约相差3 mm。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.01.001.T004表4鬼针草正交试验各组提取物的抑菌活性组号抑菌圈直径/mm敏感度组号抑菌圈直径/mm敏感度112.3++613.7++211.4++714.5+++313.4++812.8+412.4++912.4++513.5++注：抑菌圈直径d10 mm为细菌对药物表现耐药和无抑菌作用（-）；d=10 mm为轻度敏感（+）；11 mm≤d≤15 mm为中度敏感（++）；d≥16 mm为高度敏感（+++）。2.3.2最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）的测定结果选择正交试验第7组（A3B1C3D2）作为高黄酮组，选择第8组（A3B2C1D3）作为低黄酮组。分别对两组进行体外MIC和MBC的测定，鬼针草提取物的抑菌和杀菌作用见表5。由表5可知，高黄酮组MIC为15.62 g/L，MBC为125 g/L；低黄酮组MIC为31.25 g/L，MBC为250 g/L。试验结果表明，鬼针草黄酮提取物对金黄色葡萄球菌有一定的抑菌杀菌作用，且随着提取物黄酮含量升高其抑菌作用增强。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.01.001.T005表5鬼针草提取物的抑菌和杀菌作用组合鬼针草提取物浓度/(g/L)MIC/(g/L)MBC/(g/L)50025012562.531.2515.6257.812 56432A3B1C3D2------+++15.62125A3B2C1D3-----++++31.25250注：“-”代表无细菌生长，“+”代表有细菌生长。3结论本试验建立了鬼针草提取的最佳工艺方法。超声辅助回流法较传统方法提取效率较高，通过正交设计优化超声辅助回流提取的工艺参数为：鬼针草药材粉末加入10倍量50%乙醇，超声20 min，在90 ℃下回流提取40 min。经过3批验证，该工艺稳定可行，提取物得率为35.59%，黄酮含量为5.54%。本试验考察鬼针草黄酮提取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用。9组正交提取物均有抑菌作用，高黄酮组对金黄色葡萄球菌的MIC为15.62 g/L，MBC为125 g/L；低黄酮组对金黄色葡萄球菌的MIC为31.25 g/L，MBC为250 g/L。本研究结果为鬼针草资源在畜牧业的开发利用及新型饲料添加剂的研究提供参考。工艺条件参数对提取物黄酮含量的影响及对鬼针草黄酮纯化工艺的比较需要进一步深入研究。