山豆根作为一种天然中药，最初记载于《开宝本草》。2020版《中国药典》中记载，山豆根具有清火解毒、消肿止痛等功效[1]。山豆根多糖（SSP）是山豆根的有效成分之一。研究表明，SSP可以增强机体免疫功能，具有抗炎、抗病毒和抗氧化等作用[2-3]。目前，已知猪圆环病毒2型（PCV2）感染导致的机体免疫抑制可能是由病毒刺激机体产生炎性反应所致。因此，降低PCV2感染后产生的炎症至关重要[4]。本试验拟建立PCV2感染小鼠脾淋巴细胞的炎症模型，利用SSP降低PCV2感染后导致的炎症，探索合适的药物浓度和作用时间，为后续抗PCV2的药物开发提供思路。实验室前期观察了不同浓度（25~1 600 mg/L）的SSP对小鼠脾淋巴细胞活性的影响，发现当SSP浓度低于400 mg/L时对小鼠脾淋巴细胞的活力无显著影响；PCV2感染小鼠后，细胞活力显著降低，并在48 h后显著下降；而经SSP处理后，细胞活性在12 h开始升高，且在72 h内，随着时间增加细胞活性也不断升高。基于此，本试验选择使用100、200和400 mg/L的SSP处理经PCV2感染的小鼠脾淋巴细胞，并在8、12和24 h收取样品检测细胞中炎性因子的mRNA表达水平，探究SSP对PCV2感染小鼠脾淋巴细胞模型最佳给药剂量和时间，为后续试验打下基础。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验药品SSP由广西大学动物科学技术学院兽医药理与毒理学教研室制备，多糖中总糖含量为91.50%。1.1.2试验动物SPF级昆明种小鼠，4周龄，体重为（20±2）g，购自广西医科大学实验动物中心。购入后适养3~7 d，期间饮水及采食自由。1.1.3主要试剂胎牛血清（FBS）、RPMI-1640培养基（Gibco公司）；PBS（南京生航生物技术有限公司）；青、链霉素混合液及红细胞裂解液（索莱宝试剂公司）；细胞筛（SORFA公司）、RNAiso Plus（Takara公司）；All-In-One 5× RT MasterMix、BlasTaqTM2× qPCR MasterMix（abm公司）。1.1.4主要仪器电子分析天平（Mettler Toledo公司）；Centrifuge 5418离心机（Eppendorf公司）；梯度PCR仪（BIO-RAD公司）；Roche LightCycler®96实时荧光定量PCR仪（Roche公司）。1.2试验方法1.2.1小鼠脾淋巴细胞的制备小鼠颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡2 min，取出小鼠置于无菌皿；超净台内低温取出脾脏，放入盛有预冷的适量PBS液的培养皿中清洗。将脾脏放置于40 μm细胞筛网上，PBS冲洗新鲜脾脏，采用5 mL注射器针芯研磨脾脏，培养皿收集筛网滤下的脾研磨液，并转移至15 mL离心管中。加入红细胞裂解液，置于冰上裂解15 min，期间每隔5 min轻摇一次；800 r/min离心5 min，弃除上清；加入PBS轻轻吹打混匀沉淀细胞，将细胞团块吸出弃除，800 r/min离心5 min，弃除上清；再次加入PBS后800 r/min离心5 min，弃去上清；加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，轻轻吹打混匀，经40 μm筛网过滤去除细胞团块，悬浮沉淀细胞，收集细胞滤液。1.2.2试验设计试验设置细胞对照组、PCV2感染对照组、PCV2＋SSP100组（PCV2＋100 mg/L SSP）、PCV2＋SSP200组（PCV2＋200 mg/L SSP）、PCV2＋SSP400组（PCV2＋400 mg/L SSP）、SSP400组（400 mg/L SSP），共6组，每组3个重复。将细胞滤液接种于6孔板内，每孔2 mL，置于37 ℃、5% CO2条件下培养6 h后，6组均吸弃1.5 mL上清液，细胞对照组和SSP400组在细胞液中加入1 mL RPMI-1640培养基；PCV2感染对照组、PCV2＋SSP100组、PCV2＋SSP200组、PCV2＋SSP400组加入1 mL PCV2病毒液（感染剂量103 TCID50）。于37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下孵育2 h。PCV2＋SSP400组、SSP400组各组分别加入1.5 mL含800 mg/L SSP的10% FBS-RPMI-1640完全培养液；PCV2＋SSP100组、PCV2＋SSP200组各组分别加入1.5 mL含200和400 mg/L SSP的10% FBS-RPMI-1640完全培养液；细胞对照组和PCV2感染对照组加入1.5 mL的10%FBS-RPMI-1640完全培养液。于37 ℃、5 %CO2条件下分别继续培养8、12和24 h。试验分组及处理见表1。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.06.001.T001表1试验分组及处理Tab.1Grouping and processing of experiment组别病毒处理药物处理SSP终浓度细胞对照组———PCV2感染对照组PCV2——PCV2＋SSP100组PCV2200 mg/L SSP100 mg/L SSPPCV2＋SSP200组PCV2400 mg/L SSP200 mg/L SSPPCV2＋SSP400组PCV2800 mg/L SSP400 mg/L SSPSSP400药物组—800 mg/L SSP400 mg/L SSP1.2.3样品收集从细胞培养箱中取出细胞培养板，轻轻挪至超净台上，保持液面静止。将上层液体缓慢吸出，约留下1 mL，吸取剩余培养基轻轻吹打沉降在6孔板底部的细胞。将细胞连同剩余的培养基装入RNase Free EP管中，1 500 r/min 4 ℃离心5 min，弃上清；每管加入1 mL PBS吹散，再次1 500 r/min 4 ℃离心5 min，弃上清，加入1 mL的RNAiso Plus，反复吹吸，直至裂解液中无明显沉淀，静置5 min，转移至-80 ℃保存。1.2.4总RNA提取及cDNA合成将1.2.3中收集的样品按RNAiso Plus试剂说明书进行提取。提取后采用超微量分光光度计对RNA的吸光度（OD值）进行检测，OD260/280范围在1.8~2.6之间视为RNA质量合格。采用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，配置1％琼脂糖凝胶，每孔加入2.5 μL RNA样品和2.5 μL 2×RNA Loading Buffer；电压180 V，电流120 A，电泳12 min；使用凝胶成像系统观察结果，存在3条清晰、明亮的条带，RNA可进行反转录。检测合格的RNA按照All-In-One 5× RT MasterMix反转录试剂盒说明书进行反转录，得到的cDNA于-20 ℃冷冻保存。1.2.5荧光定量PCR检测炎症因子相关基因表达试验中所用的mRNA引物由南宁捷尼斯生物科技有限公司设计与合成，引物序列见表2。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.06.001.T002表2mRNA特异性引物序列Tab.2Primer sequence of mRNA基因引物序列(5'→3')产物大小/bpNF-κBF: GACCTGGAGCAAGCCATTAGR: CGCACTGTCACCTGGAAGC125MCP-1F: AACTGCATCTGCCCTAAGGTR: AGGCATCACAGTCCGAGTCA158CXCL10F: TCTCTCCATCACTCCCCTTTAR: GCTTCGGCAGTTACTTTTGTC151STAT1F: GCTGCCTATGATGTCTCGTTTGR: GCTTTTCCGTATGTTGTGCTG123β-actinF: GCTCTGGCTCCTAGCACCATR: GCCACCGATCCACACAGAGT75Q-PCR反应体系（20 μL）：BlasTaqTM 2× qPCR MasterMix 10 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、cDNA模板1 μL、ddH2O 8 μL。Q-PCR扩增条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火/延伸60 s，共40个循环；溶解曲线95 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 s；37 ℃冷却30 s。1.3数据统计与分析以β-actin作为内参基因，每个样本设置两个复孔，采用2-△△Ct法进行相对定量分析，并将细胞对照组中目的基因的表达水平设置为1。试验数据采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA）。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1感染8 h后SSP对PCV2感染脾淋巴细胞炎症因子mRNA表达水平的影响（见表3）由表3可知，在PCV2感染小鼠脾淋巴细胞8 h后，PCV2感染对照组的各炎症因子的表达水平与细胞对照组相比均有所下降，其中NF-κB、MCP-1和STAT1的表达水平与细胞对照组相比显著下调（P0.05）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.06.001.T003表3感染8 h后SSP对PCV2感染脾淋巴细胞炎症因子mRNA表达水平Tab.3Effect of SSP on expression level of inflammatory factor in spleen lymphocytes at 8 h post PCV2-infection组别NF-κBMCP-1CXCL10STAT1细胞对照组1.00±0.11a1.02±0.26a1.04±0.331.01±0.18aPCV2感染对照组0.79±0.04b0.51±0.19bc0.80±0.320.67±0.09bPCV2＋SSP100组0.75±0.02b0.31±0.05c0.94±0.140.49±0.02cPCV2＋SSP200组0.70±0.02bc0.28±0.01c0.86±0.370.43±0.13cdPCV2＋SSP400组0.70±0.07bc0.23±0.11c0.98±0.430.35±0.03cdSSP400组0.58±0.12c0.72±0.21b1.14±0.070.29±0.05d注 ：同列肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母差异不显著（P0.05）；下表同。在给予不同浓度的SSP后，NF-κB、MCP-1和STAT1的表达水平仍有所下降；与PCV2感染对照组相比，各组STAT1的表达水平均显著降低（P0.05），SSP400组的NF-κB表达水平显著降低（P0.05）。6个处理组CXCL10的表达水平差异均不显著（P0.05）。2.2感染12 h后SSP对PCV2感染脾淋巴细胞炎症因子mRNA表达水平的影响（见表4）由表4可知，在PCV2感染小鼠脾淋巴细胞12 h后，PCV2感染对照组的各炎症因子的表达水平与细胞对照组相比均显著下降（P0.05）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.06.001.T004表4感染12 h后SSP对PCV2感染脾淋巴细胞炎症因子mRNA表达水平的影响Tab.4Effect of SSP on expression level of inflammatory factor in spleen lymphocytes at 12 h post PCV2-infection组别NF-κBMCP-1CXCL10STAT1细胞对照组1.02±0.25a1.01±0.16a1.00±0.06a1.00±0.10aPCV2感染对照组0.51±0.08b0.33±0.16b0.62±0.03b0.38±0.01cPCV2＋SSP100组0.70±0.12ab0.29±0.17b0.47±0.03bc0.53±0.01bPCV2＋SSP200组0.85±0.32ab0.34±0.08b0.37±0.04cd0.19±0.05dPCV2＋SSP400组0.89±0.21a0.24±0.05b0.27±0.07d0.23±0.05dSSP400组0.93±0.11a0.81±0.19a1.04±0.18a0.27±0.02d在给予不同浓度的SSP后，MCP-1、CXCL10、STAT1的表达水平均有所降低。与PCV2感染对照组相比，PCV2＋SSP400组、SSP400组NF-κB的表达水平显著上升（P0.05）；SSP400组MCP-1的表达水平显著升高（P0.05）。CXCL10的表达水平随着SSP添加水平升高逐步降低，PCV2＋SSP200组和PCV2＋SSP400组的表达水平显著低于PCV2感染对照组和细胞对照组（P0.05）。STAT1的mRNA表达水平在经SSP处理后先降低后升高，PCV2＋SSP200组和PCV2＋SSP400组的表达水平显著低于PCV2感染对照组和细胞对照组（P0.05）。2.3感染24 h后SSP对PCV2感染脾淋巴细胞炎症因子mRNA表达水平的影响（见表5）由表5可知，在PCV2感染小鼠脾淋巴细胞24 h后，显著升高了细胞内NF-κB、MCP-1、CXCL10和STAT1的mRNA表达水平（P0.05），表明PCV2感染小鼠脾淋巴细胞的炎症模型建立成功。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.06.001.T005表5感染24 h后山豆根多糖对PCV2感染脾淋巴细胞炎症因子mRNA表达水平的影响Tab.5Effect of SSP on expression level of inflammatory factor in spleen lymphocytes at 24 h post PCV2-infection组别NF-κBMCP-1CXCL10STAT1细胞对照组1.01±0.20d1.00±0.03b1.00±0.04d1.01±0.17dPCV2感染对照组2.73±0.39a1.27±0.08a5.03±1.38a3.58±0.82aPCV2＋SSP100组2.35±0.29ab0.55±0.06d3.79±0.72ab3.63±0.04aPCV2＋SSP200组2.00±0.14bc0.52±0.02d1.82±0.87cd2.60±0.62cdPCV2＋SSP400组1.57±0.20c0.31±0.02e2.12±0.40cd2.31±0.30cSSP400组1.93±0.27bc0.82±0.13c2.57±0.25bc3.25±0.17ab经过不同浓度的SSP处理后，各组炎症因子的mRNA表达水平均有所降低。与PCV2感染对照组相比，小鼠脾淋巴细胞MCP-1的表达水平经100、200和400 mg/L的SSP处理后均显著降低（P0.05）。NF-κB、CXCL10和STAT1表达水平经100 mg/L的SSP处理后与PCV2感染对照组相比差异均不显著（P0.05）；经200和400 mg/L的SSP处理后的小鼠脾淋巴细胞与PCV2感染对照组相比均显著降低（P0.05）。小鼠脾淋巴细胞感染PCV2后，NF-κB、MCP-1、CXCL10和STAT1等4种炎症因子的表达水平在经400 mg/L的SSP处理后与PCV2感染对照组相比均显著降低（P0.05）。综上所述，SSP对于炎症因子mRNA表达水平呈现一定的剂量依赖，SSP的浓度越高，对于炎症因子表达的抑制效果越明显。3讨论猪圆环病毒（PCV）是一种单链、无囊膜的环状DNA病毒，目前已发现4种基因型：PCV1、PCV2、PCV3和PCV4[5-6]。其中PCV2的致病性最强，传播也最为广泛，由PCV2所引起的病症被统称为猪圆环病毒相关疾病（porcine circovirus associated disease，PCVD）[7]，常与其他多种病原体混合感染[8]，加重临床严重程度。目前对PCV2的治疗仅停留于常规手段，防范手段也以疫苗免疫为主。但PCV2突变率极高，感染后会导致免疫抑制[9]，使疫苗失效。因此，养殖业需要一种新的手段防治PCV2。多糖是一种从植物、藻类和动物等中分离出的天然高分子聚合物[10-11]。近年来，多糖的多种生物活性被不断发掘，在安全、环保、无耐药性的同时，多糖还具有调节机体免疫和代谢等功效。此外，多糖还被证明具有抗炎和抗病毒等药理作用[12]。黄贤能等[13]研究发现，柴胡多糖能够降低LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型中一氧化氮（NO）的含量，起到抗炎的效果。钟敏等[14]将正北芪多糖作用于结肠炎小鼠模型，结果发现，正北芪多糖能够减少肠组织的溃疡面积和炎性细胞浸润，并且降低小鼠体内IL-6、IL-1β和TNF-α等炎性因子的含量，通过改善肠道黏膜屏障和减少炎症因子释放，进而缓解小鼠结肠炎的症状。刘丹华等[15]对黄芪多糖在LPS诱导的鸡胚成纤维细胞系DF-1炎症中的作用进行了研究，结果发现，单独使用黄芪多糖处理DF-1细胞能够促进IL-1β和TNF-α的释放，从而增强免疫功能；在给予LPS刺激后再使用黄芪多糖进行处理，结果显示，黄芪多糖能够通过抑制IL-1β和TNF-α的释放起到抗炎的作用。马升等[16]研究发现，金针菇多糖能增强RAW264.7细胞的吞噬能力，通过抑制NF-κB-NLRP3信号通路的激活抑制巨噬细胞炎症反应。本试验中采用PCV2建立小鼠脾淋巴细胞的体外炎症模型，在培养体系中分别加入100、200和400 mg/L的山豆根多糖继续培养8、12和24 h；荧光定量PCR结果表明，当PCV2感染后24 h时，小鼠脾淋巴细胞内NF-κB、CXCL10和STAT1的mRNA表达水平高于细胞对照组；3种不同浓度的山豆根多糖处理后均能够降低炎性因子的表达水平，并随着剂量的升高炎性因子的表达水平越低，其中以400 mg/L的SSP的效果最佳。结果表明，400 mg/L的山豆根多糖作用于PCV2感染的小鼠脾淋巴细胞24 h后能够降低细胞内炎症因子的mRNA表达，起到抗炎的效果。4结论本试验使用荧光定量PCR法测定不同浓度的山豆根多糖对小鼠脾淋巴细胞体外感染PCV2后不同时间点的炎性因子分泌水平的影响。结果表明，400 mg/L山豆根多糖能够降低PCV2感染小鼠脾淋巴细胞产生的炎症因子mRNA表达。