牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）所引起的疾病也称为黏膜病，是世界范围内牛的一种常见感染性疾病[1]，也是最重要的牛病之一[2]。BVDV是黄病毒科瘟病毒属的一个成员[3]，可感染各年龄阶段的牛，年龄越小易感性越高。BVDV能够引起包括呼吸系统和生殖系统在内的多个器官系统疾病[4-5]，具体临床表现通常取决于感染病毒毒株的毒力，主要造成患病母牛的生育力和产奶量下降、流产以及胎儿生长缓慢等情况[6]。即使母牛妊娠期满后能够顺利产下犊牛，犊牛却对该病毒具有“免疫耐受”的现象。持续感染小牛（PI）是群体中新的重要传染源[7-8]，主要通过分泌的体液持续释放大量病毒。在幼牛身上的短暂感染（TI）可能会引起皮炎、上消化道溃疡、发热、腹泻、白细胞减少咳嗽等症状，甚至导致死亡[9]。牛病毒性腹泻在世界各国普遍存在，可严重影响牛的繁殖和生产，对养牛业造成了巨大的经济损失。牛病毒性腹泻虽然以其主要宿主命名，但在非牛物种中也具有一定的流行率。大多数野生反刍动物对BVDV易感，多种家养非牛类物种也可携带和传播此病，大多数呈短暂感染所致常见的BVDV综合征，如生殖功能不全、呼吸道疾病和免疫抑制。目前牛源性传播的可能性虽尚未完全确定，但已有研究在羊、猪、水牛、鹿和骆驼等动物中发现BVDV，且已证明BVDV可在羊牛间进行传播[10-13]。目前尚无治疗BVDV的特效药物，预防主要通过接种弱毒疫苗和灭活疫苗提高牛机体的自身免疫力[14]。尽管已有商业疫苗可用，但市面上的许多灭活疫苗和改良活疫苗仅可应用于控制部分BVDV基因。有研究表明，接种疫苗在对新断奶牛犊的预防效果上仍存在一定缺陷[15]。因此，明确该病的发病原因、加强牛群的免疫保护机制，并及时做出诊断和防治、降低感染风险，可有效降低牛产业的经济损失。1病原特征BVDV是一种病毒性疾病，病原体在显微镜下呈球形，直径约为30 mm。BVDV通常为单链的RNA结构，有囊膜。在低温环境下，病原体能够长期保存且保持良好的活力，高温和紫外线照射会对BVDV产生较强的灭活能力[16]。BVDV的基因组全长约12.3 kb，包含一个单一的开放阅读框架（ORF），编码一种多聚蛋白；该多聚蛋白可协同和翻译后加工为成熟的病毒蛋白，ORF两侧有5'和3'非翻译区（UTRs）[17]。根据对BVDV基因组5'端非编码区、N末端自身蛋白酶（NPro）区或包膜糖蛋白（E2）区部分序列的系统发育分析，BVDV通常分为两个不同的遗传物种，即BVDV-1和BVDV-2。BVDV-1毒株是主要毒株，分布于世界各地；BVDV-2毒株主要存在于美国、加拿大和南美洲，也有研究报道存在于欧洲和亚洲[18]。1980年，中国首次发现感染BVDV的病例，病毒毒株分离自一个流产的牛胎（命名为changchun 184号）。截至目前，BVDV在中国各地广泛传播，具有很高的流行率和丰富的遗传多样性。因BVDV具有较强的传播能力和感染能力，牛染病后的血液、眼鼻分泌物、尿液、精液、初乳（或乳汁）以及粪便中均含有病原，从而导致其他易感牛发病。患病牛康复之后可能长时间携带病毒，并且反复发病[19]。2牛病毒性腹泻胶体金抗原检测中不同取样方法比较2.1胶体金免疫层析技术胶体金免疫层析技术是将胶体金作为示踪物应用于硝酸纤维素膜上，在特定位置发生抗原抗体特异性反应的一种快速检测技术，以简便快速、成本低廉、安全无毒、特异性强等优点广泛应用于临床检测中。Feldherr等[20]于20世纪60年代首次提出，将胶体金作为一种电镜示踪标志物；之后Faulk等[21]将胶体金作为示踪物应用于免疫组织学的相关研究中。同酶联免疫标记（ELISA）和聚合酶链反应（PCR）技术相比较，胶体金检测技术具有更加简单、方便、快捷的优势[22]。近年来，胶体金免疫层析技术在检测应用市场拥有广阔的发展前景，在人类自身免疫缺陷病、传染病、人畜共患病和毒品检测等相关领域均有所涉及。王梦露等[23]利用间接胶体金技术建立了一种针对人血清中抗环瓜氨酸肽（CCP）抗体含量的定量检测方法，并对试验条件进行优化，以满足临床检验的需要。在动物诊断中，胶体金免疫层析技术也具有广泛的应用。为快速检测及诊断犬细小病毒及其引起的传染性疾病，刘洁等[24]研制了犬细小病毒胶体金检测试纸条，经特异性研究试验及与血凝试验的对比，证明其具有良好的敏感性和特异性，与进口产品的总符合率为98%。有研究采用胶体金标记猪瘟病毒抗原，通过双抗原夹心法建立猪瘟抗体检测体系，对不同养猪场收集的20例可疑病例进行检测，结果表明，胶体金性能与间接血凝和IDEXX实验室检测基本一致，总体符合率均在98%以上，具有较高的灵敏度，适用于猪瘟的临床诊断[25]。大量相关研究报道，胶体金技术在动物疾病诊断中能够获得比较高的检出率，表现出良好的特异性[26-28]。因此，将此技术广泛应用于动物疾病诊断方面的价值非常高[29]。2.2不同取样方法检测比较牛病毒性腹泻抗原检测的样本类型有多种，如血液（血清）、奶样、耳组织和鼻咽拭子。成年牛尾静脉采血较为方便，但对于犊牛而言，采样流程比较费时费力，采血的难度较大，且在血样采集时牛极易出现应激反应，进而对牛的健康情况造成伤害。奶样的采集方法相对简单、方便、安全，对牛基本不造成影响，但缺点是适用范围较小，仅能够实施于泌乳牛群，无法检测非泌乳牛群。耳组织的采样方法更快速、损伤小，只需采集约2~3 mm的样品，对牛几乎不会造成损伤，尤其在饲喂时进行采集更省时省力[30]。鼻咽拭子的采集方法则更加简洁，使用棉签在牛鼻腔和咽喉部位轻轻刮取即可进行快速的样品采集，对牛完全没有损伤。若母牛曾感染过BVDV或接种过BVDV疫苗，犊牛可摄入富含BVDV免疫球蛋白的初乳。已有研究表明，在使用抗原捕获酶联免疫吸附试验（ACE）时，血清样本和耳部组织样本获得的结果之间存在差异；在犊牛摄入初乳后，血清样本呈阴性，但耳组织样本在不同的生长发育阶段均呈BVDV阳性[31]，即血清中源自初乳的抗体在PI犊牛中产生假阴性结果。因此，耳组织样本被认为是能够解决初乳衍生抗体干扰的一种解决方案。在存在初乳来源抗体的情况下采用ACE检测，除耳组织外，血清、鼻拭子和唾液拭子均受到3周龄以下犊牛初乳衍生抗体的干扰[32]，其中鼻拭子的影响小于血清和唾液拭子，耳组织样本的影响最小。3牛病毒性腹泻抗原检测的假阳性3.1其他抗体干扰牛的血液样本（全血、血清、血浆）中可能存在其他抗体的干扰，导致检测结果呈假阳性。血清或血浆中的内源性异嗜性抗体，可与其他种属的免疫球蛋白进行结合，包括作为免疫分析试剂的异源抗体。上述抗体可对免疫检验体系产生干扰，造成与实际分析物浓度无关的虚高检测值，存在很大概率导致误诊。在人自身免疫性疾病（ADS）的免疫系统中会产生多种自身抗体，如类风湿因子（RF）、抗环瓜氨酸肽（抗CCP）和抗核抗体（ANA），可能导致交叉反应和血清学检测的假阳性结果。免疫分析的假阳性结果往往是由于自身抗体、异嗜性抗体和血清中的补体与检测试剂中的抗体结合导致，但这些结合往往是非特异性的，且弱于特异性反应。在SARS-CoV-2抗体检测中，血清中高类风湿因子（RF）水平升高可能导致假阳性结果，尿素解离试验有助于降低假阳性结果的发生率，使用高纯度的抗体和适当的阻断剂有助于提高其检测的特异性[33]。因此，推测BVDV抗原检测假阳性的出现可能与患牛的血液样本中存在其他抗体的干扰有关。3.2药物和样本基质成分干扰在牛病毒性腹泻检测过程中，药物和样本基质成分会对测试结果造成假阳干扰。首先，患牛若在测试之前服用过其他药物，药物将会通过体内代谢作用改变待测血液样本的浓度和pH值，造成假阳性。其次，由于药物本身或其代谢产物对免疫分析产生的效应造成体外干扰。再次，血液样本（全血、血清、血浆）基质中含有的其他成分和本身的不稳定性也可能产生假阳性干扰。其中，血浆样本的主要干扰因素是血浆中含有纤维蛋白原和抗凝剂。在远程运输中，血清样本的某些物质会发生不稳定性释放。跨国运输的对照血清在测试中出现了阳性干扰，此干扰是由于运输过程中对照血清的非酯化脂肪酸释放造成的。据推测，非酯化脂肪酸进行非特异性地结合血清蛋白，发生了竞争抗体结合位点现象，导致了测试结果的假阳性。也有试验表明，某厂家的牛病毒腹泻病毒抗原即时检测产品在测试患牛血液样本时会出现假阳性，更换使用耳组织样本检测且其他条件保持不变时，则不存在假阳干扰[32]。因此，在BVDV抗原的胶体金检测中，患牛的血液样本可能存在干扰物质造成结果异常，此时可选用耳组织进行检测。4结论综上所述，在牛病毒性腹泻BVDV抗原检测的不同取样方法比较中，奶样适用范围小，血样采集难度大，且在初乳喂养的PI犊牛检测中存在误差。鼻拭子和唾液拭子上清液在初乳衍生抗体存在的情况下，表现出与血清相似的检测局限性。耳组织是相对较好的样本选择，取样快速，对牛的损伤小，还能够避免初乳衍生抗体干扰问题。此外，血液样本（全血、血清、血浆）中假阳性的出现可能是由于存在其他抗体、药物和基质成分的干扰。为提高后续BVDV抗原检测的临床诊断和治疗水平，加强对血液样本中产生的假阳性原因分析并做出合理的解决方案，建议采用更加简便、快捷的耳部组织样本取样方法，减少初乳衍生抗体和假阳干扰。