角质细胞生长因子2（KGF-2）是成纤维细胞生长因子家族（FGFs）的一员，也称成纤维细胞生长因子-10（FGF10）。KGF-2分子全长627 bp，编码蛋白由208个氨基酸残基组成[1]。KGF-2具有促进上皮细胞生长、增殖和分化的功能[2]，参与并调控多种组织器官的形成。有研究发现，敲除KGF-2基因大鼠的肺和前后肢未发育，牙齿和毛囊等也存在发育缺陷[3]。有研究认为，KGF-2存在于真皮乳突中，对皮肤组织和毛囊的发育具有调控作用[4]。严家荣等[5]研究发现，重组角质细胞生长因子2（rhKGF-2）对治疗试验大鼠角膜烧伤的效果较好；马丽等[6]研究发现，烫伤大鼠外用rhKGF-2可促进皮肤伤口愈合和毛发再生；王泽[7]研究发现，脱毛大鼠采用rhKGF-2涂抹给药，试验后第14 d可明显看到毛发再生。上述文献启示，外源KGF-2可调控动物的毛发生长。柳楠等[8]对敖汉细毛羊不同部位皮肤毛囊中FGF10的mRNA和蛋白表达量进行对比研究发现，FGF10的蛋白表达量与毛囊发育存在正调节作用。羊绒是绒山羊皮肤内次级毛囊生长的一类无髓毛，经济价值非常高。本试验设想通过外源给药的方式，将rhKGF-2补充进绒山羊皮内，探讨其能否促进其次级毛囊发育，提升产绒量。已有文献多数采用外用涂抹给药方式，但在绒山羊生产实际中没有可操作性；外源补充rhKGF-2在动物体内存留量和存留时间决定了其发挥效果的显著性。本研究主要探讨rhKGF-2不同方式和不同剂量对绒山羊体内KGF-2浓度的影响，期望筛选出适宜的剂量参数和合适的给药方法，实现一次性给药使动物体内KGF-2浓度维持较长时间，为后续研究KGF-2调控绒山羊绒毛生长提供参考。1材料与方法1.1试验设计试验动物来自辽宁省辽宁绒山羊原种场，选择24只5~7月龄、体重为（26.95±1.87）kg的辽宁绒山羊，公母各半，随机分为4组，每组6只羊。试验设计与各处理体重见表1。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.06.003.T001表1试验设计与各处理体重Tab.1Design of experiment and body weight of each treatment组别低剂量水平（10 μg/kg）中剂量水平（20 μg/kg）高剂量水平（30 μg/kg）试验1组26.07±4.4726.07±4.4726.07±4.47试验2组26.87±4.0626.87±4.0626.87±4.06试验3组24.33±3.7924.33±3.7924.33±3.79试验4组（对照组）26.94±3.5226.94±3.5226.94±3.52kg试验1组皮下注射rhKGF-2胶原蛋白溶液，试验2组皮下注射rhKGF-2温敏感凝胶溶液，试验3组皮下注射rhKGF-2生理盐水溶液；试验4组为对照，不做KGF-2处理。本试验设3个周期，每个周期18 d，依次给予低、中、高等3个剂量[9-10]处理，分别为每只羊每日10、20、30 μg/kg。1.2试剂及制备方法本试验所使用的rhKGF-2购自成都云希化工有限公司，纯度为95%。胶原蛋白粉和温敏感凝胶购自沈阳鼎国生物科技公司。1.2.1rhKGF-2胶原蛋白溶液的制备在无菌操净台下，分别称量5 mg和55 mg的rhKGF-2和胶原蛋白粉[11]于灭菌的10 mL离心管中，加入温度为15~18 ℃的灭菌超纯水6 mL，玻璃棒搅动，涡旋振荡器振荡3~5 min，KGF-2和胶原蛋白粉充分混匀，达到静止30 min后不分层的状态。将溶液分装于1.5 mL离心管中，-20 ℃保存。1.2.2rhKGF-2温敏感水凝胶溶液的制备温敏感水凝胶制备方法参照Chen等[12]的冷溶法。在无菌操净台下，称量2.2 g温敏感凝胶于灭菌的10 mL离心管中，加入温度为4 ℃的灭菌超纯水6 mL，玻璃棒搅动，振荡器振荡5~10 min，温敏感凝胶充分混匀，无气泡和小的凝胶颗粒。在操作过程中利用冰块间断性地对离心管降温，4 ℃条件下静置过夜，形成透明溶液。称量5 mg的rhKGF-2加入离心管的溶液，再次振荡混合，达到充分混匀、完全溶解、无气泡、无颗粒、不分层的状态，分装，0~4 ℃保存。1.2.3rhKGF-2生理盐水溶液的制备在无菌操净台下，分别称量rhKGF-2和灭菌生理盐水5 mg和11 mL于灭菌的15 mL离心管中，涡旋振荡器振荡5~8 min，使溶液完全混匀。分装保存同1.2.1。1.3试验方法试验当日上午，试验动物称重。14：30各组试验动物分别于左侧颈部皮下注射，注意将温敏凝胶试剂管始终放置于0~4 ℃左右的低温盒中取用。注射数量=剂量水平×体重×18（1）1.4测定指标及方法在试验处理前以及处理后6、18、42、90、138、210、258、354、426 h，分别采集试验羊静脉血5 mL，3 500 r/min离心15 min，制备血清，分装至1 mL离心管，-20 ℃冷冻保存。采用ELASA法，应用华卫德朗DR-200BS酶标分析仪测定绒山羊血清KGF-2水平。1.5数据统计与分析采用Excel 2010软件处理原始数据，SPSS 19.0软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA），Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同剂量rhKGF-2处理下绒山羊血清KGF-2浓度的变化2.1.1低剂量rhKGF-2处理下绒山羊血清KGF-2浓度的变化（见表2）由表2可知，3个试验组血清KGF-2浓度均随着时间推移呈先增加后降低的趋势，对照组未发生显著波动。试验处理6 h后，3个试验组血清KGF-2浓度均显著高于对照组（P0.05）。处理18 h后，3个试验组血清KGF-2浓度均极显著高于对照组（P0.01）。处理42 h后，3个试验组血清KGF-2浓度均极显著高于对照组（P0.01），同时试验1组显著高于试验3组（P0.05）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.06.003.T002表2低剂量rhKGF-2处理下绒山羊血清KGF-2浓度的变化Tab.2Changes of serum KGF-2 concentration in Cashmere goats treated with low-dose rhKGF-2时间/h试验1组试验2组试验3组试验4组（对照组）04.25±0.134.26±0.134.24±0.144.33±0.1565.95±0.32a6.40±0.93a6.10±0.27a4.29±0.26 b187.22±0.37A6.94±0.59A6.92±0.28A4.32±0.28B427.36±0.19 Aa7.02±0.38 Aab6.26±0.37Ab4.30±0.18Bc906.37±0.18A6.43±0.46A5.17±0.33B4.33±0.07B1385.90±0.32ABa5.99±0.42Aa4.71±0.23BCbc4.36±0.16Cc2105.11±0.255.22±0.284.59±0.284.31±0.132584.48±0.154.50±0.134.35±0.224.27±0.103544.33±0.154.34±0.144.30±0.164.29±0.094264.25±0.154.29±0.134.27±0.194.27±0.10注 ：同行数据肩标不同大写字母表示差异极显著（P0.01），不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。ng/L处理90 h后，试验1组和试验2组血清KGF-2浓度均极显著高于试验3组和对照组（P0.01）。处理138 h后，试验1组血清KGF-2浓度极显著高于对照组（P0.01），并显著高于试验3组（P0.05），试验2组极显著高于试验3组和对照组（P0.01）。处理210 h及之后，各试验组血清KGF-2浓度差异均不显著（P0.05）。从处理前到处理后258 h，3个试验组均在试验处理后42 h达到高峰，其后逐步降低，对照组随着时间推移血清KGF-2浓度无显著的变化。从血清KGF-2浓度绝对值看，试验1组和试验2组在各时间点均略高于试验3组，3个试验组在此期间均高于对照组。2.1.2中剂量rhKGF-2处理下绒山羊血清KGF-2浓度的变化（见表3）由表3可知，各试验组血清KGF-2浓度均呈先增加后降低的趋势，对照组未发生显著波动，浓度比较平稳。在试验处理6~42 h后，3个试验组血清KGF-2浓度均极显著高于对照组（P0.01）。处理90 h后，试验1组和试验2组血清KGF-2浓度极显著高于对照组（P0.01），试验3组显著高于对照组（P0.05）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.06.003.T003表3中剂量rhKGF-2处理下绒山羊血清KGF-2浓度的变化Tab.3Changes of serum KGF-2 concentration in Cashmere goats treated with middle-dose rhKGF-2时间/h试验1组试验2组试验3组试验4组（对照组）04.32±0.214.40 ±0.284.30±0.134.29±0.1564.96±0.10A5.17±0.15A5.14±0.08A4.24±0.14B186.36±0.49A6.08±0.39 A6.79±0.03A4.33±0.40B426.72±0.73A6.87±0.47A7.31±0.11A4.31±0.35B907.66±0.91Aa7.31±0.68Aa6.32±0.14ABb4.36±0.22Bc1387.74±0.85Aa6.88±0.29ABa5.31±0.10BCbc4.34±0.34Cc2106.91±0.36A6.70±0.28A4.43±0.23B4.32±0.26B2585.85±0.07A5.74±0.41A4.31±0.21B4.33±0.26B3544.96±0.144.78±0.364.31±0.184.32±0.184264.34±0.084.31±0.274.28±0.214.32±0.19ng/L处理138 h后，试验1组血清KGF-2浓度极显著高于试验3组和对照组（P0.01）；试验2组显著高于试验3组（P0.05），并极显著高于对照组（P0.01）；试验3组高于对照组，但差异不显著（P0.05）。在处理210~258 h后，试验1组和试验2组血清KGF-2浓度极显著高于试验3组和对照组（P0.01）；试验3组与对照组差异不显著（P0.05）。试验处理后354 h后，各组间差异均不显著（P0.05）。从处理前到处理后426 h，试验1组血清KGF-2浓度在试验处理后138 h达到高峰，试验2组则在90 h达到高峰，试验3组在42 h后达到高峰，其后各组均降低；其中试验1组和2组呈近似抛物线形式下降，但试验3组浓度呈近似直线形式急剧下降。对照组随着时间推移血清KGF-2浓度无显著的变化。从血清KGF-2浓度绝对值看，试验1组和试验2组在各时间点明显高于对照组，同时试验1组总体上高于试验2组，试验3组自210 h后，与对照组基本无显著差异。2.1.3高剂量rhKGF-2处理下绒山羊血清KGF-2浓度的变化（见表4）由表4可知，各试验组血清KGF-2浓度均呈现随着时间推移先增加后降低的趋势，对照组血清KGF-2浓度未发生显著波动。试验处理6~18 h后，3个试验组血清KGF-2浓度均极显著高于对照组（P0.01），同时试验3组显著高于试验1组和2组（P0.05）。在试验处理后42 h后，3个试验组血清KGF-2浓度均极显著高于对照组（P0.01）。试验处理90~138 h后，试验1组和2组极显著高于试验3组和对照组（P0.01），试验3组极显著高于对照组（P0.01）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.06.003.T004表4高剂量rhKGF-2处理下绒山羊血清KGF-2浓度的变化Tab.4Changes of serum KGF-2 concentration in Cashmere goats treated with high-dose rhKGF-2时间/h试验1组试验2组试验3组试验4组（对照组）04.23±0.214.32±0.074.31±0.134.32±0.1065.22±0.12Aab5.04±0.13Aa5.45±0.10Ab4.35±0.05Bc186.23±0.36Aa6.37±0.07Aa6.98±0.08Ab4.37±0.10Bc427.17±0.49Aa7.45±0.12Aa7.85±0.16Aa4.23±0.22Bb907.75 ±0.24Aa8.05±0.21Aa6.74±0.14Bb4.31±0.19Cc1388.38±0.60Aa7.84±0.21Aa5.39±0.10Bb4.23±0.07Bc2108.05±0.17Aa7.14±0.06Bb4.63±0.25Cc4.29±0.09Cc2586.93±0.27Aa6.57±0.12Aa4.31±0.21Bb4.23±0.18Bb3545.67±0.21Aa5.78±0.05Aa4.31±0.18Bb4.33±0.09Bb4264.66±0.21ABab5.00±0.05Aa4.28±0.21Bb4.27±0.08Bbng/L试验处理210 h后，试验1组极显著高于其他组（P0.01），试验2组极显著高于试验3组和对照组（P0.01）。试验处理258~354 h后，试验1组和2组极显著高于试验3组和对照组（P0.01）。试验处理426 h后，试验1组显著高于试验3组和对照组（P0.01），试验2组极显著高于试验3组和对照组（P0.05）。自处理210 h后，试验3组与对照组差异不显著（P0.05）。按照时间轴来对比，试验1组血清KGF-2浓度在试验处理后138 h达到高峰，试验2组则在90 h达到高峰，试验3组为42 h达到高峰，其后逐步降低，对照组随着时间推移血清KGF-2浓度无显著的变化。从血清KGF-2浓度绝对值看，试验1组和试验2组在各时间点均明显高于对照组。2.2各处理方式下绒山羊血清KGF-2浓度的变化2.2.1胶原蛋白溶液处理方式下绒山羊血清KGF-2浓度的变化（见图1）由图1可知，随着注射剂量增加，血清中KGF-2的峰值出现时间由42 h逐渐延后至138 h；从各个时间点的血清KGF-2的绝对值看，提高注射剂量可使血清KGF-2浓度增加、延长血清KGF-2高水平维持时间。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.06.003.F001图1胶原蛋白溶液处理方式下绒山羊血清KGF-2浓度的变化Fig.1Changes of serum KGF-2 concentration in Cashmere goats treated with collagen solution2.2.2温敏感凝胶溶液处理方式下绒山羊血清KGF-2浓度的变化（见图2）由图2可知，检测到随着剂量的增加，血清KGF-2浓度高峰出现时间由18 h顺延至90 h；在42 h后，增加处理剂量可使血清KGF-2浓度增加；提高处理剂量可使血清KGF-2高浓度（高于对照组）维持时间增加至426 h。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.06.003.F002图2温敏感凝胶溶液处理方式下绒山羊血清KGF-2浓度的变化Fig.2Changes of serum KGF-2 concentration in Cashmere goats treated with temperature-sensitive gel solution2.2.3生理盐水溶液处理方式下绒山羊血清KGF-2浓度的变化（见图3）由图3可知，低剂量rhKGF-2生理盐水溶液皮下注射，在处理18 h后，血清KGF-2浓度即开始断崖式降低，在138 h接近于试验前水平和对照组水平；中剂量试验和高剂量试验表明，在处理42 h后血清KGF-2浓度达到最高峰，之后呈迅速下降，138~210 h即下降至试验前或对照组水平。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.06.003.F003图3生理盐水溶液处理方式下绒山羊血清KGF-2浓度的变化Fig.3Changes of serum KGF-2 concentration in Cashmere goats treated with normal saline solution3讨论KGF-2对皮肤组织损伤修复[13]和毛囊发育具有重要影响[6]，研究其对绒山羊毛囊发育的作用在生产中具有极大的意义。外源补充rhKGF-2对绒山羊毛囊发育的作用要依靠体内持续的高浓度KGF-2水平，其作用效果主要受给药方式和给药剂量的影响。3.1不同剂量rhKGF-2处理下绒山羊血清KGF-2浓度的变化在相同剂量下，以胶原蛋白溶液、温敏感凝胶和生理盐水方式给绒山羊补充rhKGF-2，均可使血清KGF-2浓度先升高而后缓慢下降。低剂量补充rhKGF-2后，3种处理的绒山羊血清KGF-2浓度在42 h即达到顶峰，而后下降，至240 h左右与对照组相近。中剂量组在138 h前达到顶峰，之后开始下降，至408 h左右与对照组相近。高剂量组则在426 h仍高于对照组。因此，从绒山羊血清KGF-2高浓度维持时间看，高剂量组更适宜。3.2不同rhKGF-2处理方式下绒山羊血清KGF-2浓度的变化3.2.1胶原蛋白溶液处理方式下绒山羊血清KGF-2浓度的变化在胶原蛋白溶液给药方式下，不同处理剂量对血清KGF-2的浓度和维持时间均具有一定影响，本研究设置的低、中、高3个剂量分别为10、20、30 μg/kg，主要参考宗英[9]和郑杰民等[10]的毒性试验研究得出的KGF-2安全剂量以及王泽等[4]对试验秃毛大鼠每日涂抹给药剂量而设计。利用胶原蛋白作为rhKGF-2的载体可以制作成具有缓释作用的制剂，蔡敏倩[11]以猪皮为原料提取出胶原蛋白，并以此胶原蛋白为原料与KGF-2复合制作成了KGF-2生物蛋白复合海绵，该复合物能在25 ℃和37 ℃下稳定保存6个月，经过测定其KGF-2可缓慢释放14 d，释放量为51.33%。本研究利用胶原蛋白作为骨架材料制成rhKGF-2胶原蛋白溶液，通过皮下注射进辽宁绒山羊体内。注射不同剂量rhKGF-2胶原蛋白溶液后发现，随着注射剂量增加，血清中KGF-2的峰值出现时间从42 h逐渐延后到138 h，从各个时间点的血清KGF-2的绝对值看，提高注射剂量可使血清KGF-2浓度增加、延长血清KGF-2高水平维持时间。3.2.2温敏感凝胶溶液处理方式下绒山羊血清KGF-2浓度的变化温敏感水凝胶是一类具有温敏感特性的智能高分子材料[14-15]，可以吸收并保留大量水而维持其三维网络结构，能够应对环境的改变产生智能性响应，是人医载药系统中一类特殊的载体[16]，常利用温敏感水凝胶制作成微囊给药[17],从而达到缓释效果。本试验所采用的温敏感凝胶是N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）是热缩温敏水凝胶的一种，在低温下该凝胶溶于水中形成液态凝胶；当温度高于32~35 ℃时，则聚合形成聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAM）的固态凝胶。该聚合物可形成网络结构，可作为药物缓释载体[18]。利用温敏感材料做KGF-2缓释载体可以产生延缓KGF-2释放速度的作用[19]，生长因子和合适的载体材料组合可以防止蛋白酶水解，有效保护和缓慢释放生长因子[20]。付文亮等[21]曾利用壳聚糖、壳聚糖季铵盐等配制成温敏感材料与KGF-2复合，形成一种敷料，其KGF-2的蛋白活性可基本保持稳定，并具有一定的缓释效果。本试验将KGF-2在4 ℃下与NIPAM溶解制成溶液，注射到试验绒山羊皮下。由于羊的体表温度高于32 ℃，即可形成PNIPAM，KGF-2存在于凝胶网络中即可发挥缓释效果。本试验皮下注射了低、中、高等3个剂量的rhKGF-2，结果显示，随着剂量的增加，血清KGF-2浓度高峰出现时间由18 h顺延至90 h；在处理42 h后，增加处理剂量可提高血清KGF-2浓度；提高处理剂量可使血清KGF-2高浓度（高于对照组）维持时间增加至426 h。3.2.3生理盐水溶液处理方式下绒山羊血清KGF-2浓度的变化生理盐水是动物给药常用的溶剂。本研究发现，低剂量rhKGF-2生理盐水溶液皮下注射18 h后，血清KGF-2浓度即开始断崖式降低，在138 h接近于试验前水平和对照组水平；中计量试验和高剂量试验表明，在42 h时，血清KGF-2浓度达到最高峰，之后呈迅速下降，138~210 h即下降至试验前或对照组水平。由此可知，用生理盐水溶液注射给药后羊体内rhKGF-2快速吸收、快速代谢分解，无法持续发挥作用，此方式在生产实际中的可操作性不强，应用的局限性较大。综上可知，提高rhKGF-2的剂量均增加了试验绒山羊血清KGF-2的浓度，使血清KGF-2峰值延时出现，使血清KGF-2高浓度（高于对照组）维持时间延长至426 h。合适的缓释时间是rhKGF-2调控羊的绒毛生长在生产中能否施行的关键；本研究发现，给予30 μg/kg的剂量可使缓释时间达到接近18 d，效果较为理想。对比胶原蛋白和温敏感凝胶这两种处理方式发现，二者对KGF-2的延时释放效果相似，且各具优势。胶原蛋白溶液方式处理后血清KGF-2浓度更高，温敏感凝胶处理后羊血清KGF-2浓度在峰值之后下降更平缓；但rhKGF-2温敏感凝胶溶液制作过程中要求在低温条件下操作，否则凝胶不易溶解，比胶原蛋白方式操作复杂。综上所述，在本研究条件下认为，采用KGF-2胶原蛋白溶液更合适。4结论按照30 μg/（kg·d）的剂量配制KGF-2胶原蛋白溶液皮下注射绒山羊后，绒山羊的血清KGF-2浓度在138 h达到高峰，血清KGF-2高浓度（高于对照组）维持时间可达426 h。因此，本试验条件下rhKGF-2的适宜补充剂量为30 μg/kg，合适的给药处理方式是胶原蛋白溶液。