牛膝菊（Galinsoga parviflora Cav.）又名辣子草、向阳花、铜锤草，为菊科牛膝菊属的一年生草本植物，原产南美洲，在世界范围内广泛分布[1]。目前，牛膝菊在我国的城市绿化带、农村田间地头均有生长，基本定位是杂草。关于采用除草剂抑制牛膝菊生长以及应用植物化感作用实现对牛膝菊的绿色防控已有研究[2-5]。与抑制和防控牛膝菊相比，合理应用牛膝菊更能够节约能源。孟宪东等[6]研究表明，牛膝菊可以作为饲草若与其他饲粮搭配，鸡、鸭等家禽喜欢啄食。武玉祥等[7]将牛膝菊纳入野生牧草，进行了基因多态性研究。由于牛膝菊的生命力顽强，若开发为功能性牧草，将对畜牧业产生较大的益处；若能开发牛膝菊的药用价值则可拓宽天然药物的来源。有研究表明，牛膝菊具有抗结核菌[8]、抗炎作用[9]。袁钦和等[10]报道，牛膝菊外用可治疗带状疱疹。目前，有关牛膝菊化学成分的文献报道较少，仅有报道牛膝菊含萜类和甾醇类成分[11]。牛膝菊中含有大量的黄酮类物质，黄酮类物质结构中含有较多的酚羟基，具有一定抗氧化活性，而过氧化是多种疾病的发病机制。因此，对牛膝菊黄酮的研究具有一定的实际意义。本研究采用双水相提取法提取牛膝菊总黄酮，Box-Behnken法优化牛膝菊总黄酮的提取工艺，通过研究牛膝菊总黄酮对OH·、·O2-的清除效果，测定牛膝菊总黄酮的抗氧化活性，以期为牛膝菊的深度开发提供参考。1材料与方法1.1试验材料牛膝菊采自河北省张家口市，经河北北方学院中医学院李刚教授鉴定为牛膝菊（Galinsoga parviflora Cav.）全草；芦丁标准品（批号：AB1520，成都埃法生物科技有限公司）；其余试剂均为国产分析纯。1.2主要仪器Alpha-1900双光束扫描型紫外可见分光光度计（上海谱元仪器有限公司）、万分之一电子分析天平（赛多利斯公司）、PHS-3C 数字酸度计（上海大普仪器有限公司）、JA-200超声清洗仪（济宁奥超电子设备有限公司）。1.3测定指标及方法1.3.1牛膝菊总黄酮含量1.3.1.1供试品溶液的制备将低温烘干的牛膝菊地上部分粉碎为粗粉，加适量乙醚浸泡过夜，除去脂溶性成分。精密称取相当于10 g牛膝菊的脱脂牛膝菊粗粉，加乙醇-硫酸铵双水相溶剂（pH值2）300 mL，超声（120 W）辅助提取，提取液过滤，静置分层，精密吸取上层液30 mL，定容于50 mL容量瓶，得供试品溶液。1.3.1.2标准曲线的制备精确称取干燥至恒重的芦丁对照品4.00 mg，60%乙醇溶液定容至10 mL容量瓶中，分别吸取一定量的上述溶液，配制浓度为0、0.016、0.032、0.048、0.064、0.080 g/L的梯度标准溶液。采用亚硝酸钠-硝酸铝法显色[12]，于510 nm波长处测定各溶液吸光度，以吸光度（A）作为纵坐标，芦丁标准溶液的浓度（C）作为横坐标，绘制标准曲线，结果标准曲线为y=11.518 0x-0.001 4，R2=0.999 6，表明芦丁在0~0.080 g/L浓度范围内线性关系良好。1.3.1.3精密度试验取0.048 g/L对照品溶液适量，按1.3.1.2中方法测定吸光度（RSD），重复测定5次。结果RSD为2.66%（n=5），表明精密度良好。1.3.1.4稳定性试验取供试品溶液适量，显色后，分别在25、50、75、100、125 min测定RSD。结果RSD为3.77%（n=5），表明样品溶液显色后在125 min内稳定。1.3.1.5重复性试验精密称取相当于牛膝菊10 g的脱脂牛膝菊粗粉6份，按1.3.1.1中方法制备供试品溶液，测定RSD。结果RSD为2.92%（n=6），表明重复性试验良好。1.3.1.6加样回收试验精密称取3份已知含量的脱脂牛膝菊粗粉各5.00 g，分别精密加入0.016 g/L芦丁标准溶液0.5 mL，按1.3.1.1中方法制备供试品溶液，测定RSD。结果平均回收率为100.81%，RSD为3.97%（n=3），表明方法回收率良好。1.3.2双水相提取工艺优化1.3.2.1单因素试验配制30%~60%乙醇溶液，按照0.4 g/mL加入硫酸铵[13]；采用18%盐酸调pH值至2，充分搅拌，静置后溶液出现分相。固定其他因素的水平，分别测定乙醇浓度为20%、30%、40%、50%、60%、70%；液料比为10、30、50、70、90 mL/g；超声时间为10、20、30、40、50、60 min时各因素对总黄酮的提取率。1.3.2.2Box-Behnken试验设计及响应面分析根据Box-Behnken试验设计原理，黄酮总提取率为评价指标（Y），根据单因素试验结果，选择乙醇浓度（A）、超声时间（B）、液料比（C）为影响因素，采用3因素3水平的响应曲面分析方法，共17个试验点：其中5个为中心点，12个为析因点。试验因素与水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.020.T001表1试验因素与水平设计水平A/%B/minC/(mL/g)-1302030040305015040701.3.3牛膝菊总黄酮抗氧化活性探究1.3.3.1OH·的清除作用采用邻二氮菲－Fe2+氧化法测定清除羟自由基的能力，具体步骤参照王洪彪[14]方法略有改动。于511 nm测定RSD，计算牛膝菊总黄酮对羟自由基的清除率。OH·清除率=[(A1-A2)/(A0-A2)]×100%(1)式中：A1为样品组RSD，A0为对照组RSD，A2为空白组RSD。1.3.3.2·O2-清除能力参照文献[15]中的邻苯三酚自氧化法，于320 nm测定RSD，计算牛膝菊总黄酮对超氧阴离子自由基的清除率。·O2-清除率=(1-AC/A0)×100%(2)式中：A0为空白对照RSD；AC为样品RSD。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1乙醇浓度对总黄酮的提取率的影响（见表2）由表2可知，随着乙醇浓度的增加，牛膝菊总黄酮提取率不断增加，当乙醇浓度达到40%时，牛膝菊总黄酮的提取率达到最大，继续增加乙醇浓度牛膝菊总黄酮的提取率明显下降。因此，选择30%~50%乙醇进行优化。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.020.T002表2乙醇浓度对总黄酮的提取率的影响项目乙醇浓度/%203040506070总黄酮提取率4.4794.6565.2384.5234.3794.002%2.1.2液料比对总黄酮提取率的影响（见表3）由表3可知，随着液料比增大，牛膝菊总黄酮提取率不断增加，当液料比达到50 mL/g时，牛膝菊总黄酮的提取率达到最大，继续增加液料比牛膝菊总黄酮提取率明显下降。因此，选择液料比在30~70 mL/g进行优化。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.020.T003表3液料比对总黄酮的提取率的影响项目液料比/(mL/g)1030507090总黄酮提取率4.0114.6235.3124.6994.103%2.1.3超声时间对总黄酮提取率的影响（见表4）由表4可知，随着超声时间的增加，牛膝菊总黄酮的提取率不断升高，当超声时间达到30 min时，牛膝菊总黄酮的提取率达到最大，继续增加超声时间牛膝菊总黄酮的提取率变化不明显，略有下降。因此，选择提取时间在20~40 min进行优化。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.020.T004表4超声时间对总黄酮的提取率的影响项目超声时间/min102030405060总黄酮提取率4.3544.9815.0264.7844.2214.219%2.2提取工艺响应面优化结果（见表5~表7、图1~图3）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.020.T005表5Box-Behnken试验设计方案与结果试验号A/%B/minC/(mL/g)提取率/%1-1-105.23221-104.7633-1105.02841104.8265-10-15.195610-15.2337-1015.22881014.38290-1-15.0351001-15.015110-115.203120114.788130005.280140005.199150005.399160005.469170005.504注：1~12为析因试验，13~17为中心试验。利用Design Expert V8. 0. 6. 1对表2中的牛膝菊总黄酮提取率结果进行多元二次回归拟合分析，得到模型回归方程。提取率=-1.629 05+0.180 22A+0.112 95B+0.0926 19C+6.750 00×10-4AB-1.105 00×10-3AC-4.937 50×10-4BC-2.043 50×10-3A2-2.036 00×10-3B2-3.908 75×10-4C2。由表6可知，模型决定系数R2=0.885 0，P=0.013 7，说明本回归模型自变量与因变量的回归关系显著，且失拟项P=0.299 9，失拟项不显著，说明二次多项回归方程拟合程度良好，具有统计学意义。回归方程代表性较好，能够准确预测实际情况，使用该方程代替真实的试验点进行分析是可行的。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.020.T006表6响应曲面方差分析项目平方和自由度均方F值P值显著性模型1.17090.1306.020.013 7*A0.27010.27012.670.009 2**B0.04110.0411.920.208 3C0.09610.0964.450.072 7*AB0.01810.0180.830.393 7AC0.20010.2009.050.019 7*BC0.03910.0391.810.220 8A20.18010.1808.150.024 5*B20.17010.1708.090.024 9*C20.10010.1004.770.065 3*残差0.15070.022失拟项0.08530.0281.720.299 9纯误差0.06640.016总和1.32016注：1.“**”表示影响极显著（P0.01），“*”表示影响显著（P0.05）。2.R2=0.885 5，RAdj2=0.738 3。各因素对牛膝菊总黄酮提取率的影响大小为ACB，方程的一次项A对响应值的影响极显著，二次项A2、B2、C2对响应值的影响显著，交互项AC对响应值的影响显著，表明各因素与响应值不是简单的线性关系。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.020.F001图1乙醇浓度和提取时间对总黄酮提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.020.F002图2乙醇浓度和液料比对总黄酮提取率的影响由图1~图3可知，液料比与乙醇浓度的响应面曲面较陡，表明其交互作用对牛膝菊总黄酮提取率的影响显著，而乙醇浓度和提取时间、提取时间和液料比的响应面曲线较平滑，表明其交互作用对牛膝菊总黄酮提取率的影响较小。各交互因素的响应面存在最高点，即在所选的范围内存在极值，说明各因素考察范围较为适当。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.020.F003图3提取时间和液料比对总黄酮提取率的影响经分析得到最佳提取工艺为：乙醇浓度34.04%、提取时间26.48 min以及液料比53.41 mL/g，在此条件下，牛膝菊总黄酮的提取率为5.427%。为方便操作，将最佳工艺参数调整为：乙醇浓度34%、提取时间27 min、液料比53 mL/g。称取相当于牛膝菊10 g的脱脂牛膝菊3份，采用Box-Behnken试验设计确定的最佳提取工艺，提取并测定总黄酮含量。验证试验见表7。由表7可知，牛膝菊总黄酮平均提取量为5.425%，与理论值5.427%接近，表明方程拟合度良好，优化的提取工艺稳定可靠。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.020.T007表7验证试验试验号牛膝菊总黄酮含量%吸光度平均含量15.4190.115.42525.43135.425%2.3牛膝菊总黄酮抗氧化活性结果2.3.1膝菊总黄酮提取液及VC对OH·清除作用（见图4）由图4可知，随着提取液浓度增大，OH·的清除率增大。在浓度0.1~0.3 g/L时，牛膝菊总黄酮提取液对OH·的清除率大于VC。当浓度达到0.6 g/L时，总黄酮提取液对羟自由基的清除率达到75.0%，表现出对OH·较强的清除效果，其作用与VC作用相近。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.020.F004图4牛膝菊总黄酮提取液及VC对OH·清除作用2.3.2膝菊总黄酮提取液及VC对·O2-清除作用（见图5）由图5可知，在0.1~0.6 g/L浓度范围内，牛膝菊总黄酮提取物对·O2-清除能力随着浓度增加而增强至平稳；其对·O2-清除率略高于同质量浓度的VC，当牛膝菊总黄酮提取物质量浓度为0.6 g/L时，其清除率达到92.5%。结果表明，牛膝菊总黄酮提取物对·O2-具有较好的清除能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.020.F005图5牛膝菊总黄酮提取液及VC对·O2-清除作用3讨论双水相体系提取黄酮的方法优于单纯采用乙醇提取，优点主要体现在双水相体系分层之前，提取溶剂是乙醇水溶液，由于水的穿透能力强可最大限度地提取植物中的有效成分，提取率明显高于仅采用乙醇的提取；双水相体系能够富集黄酮，原理是硫酸铵中的负离子结合乙醇溶液中的H离子，进而吸收乙醇溶液中的水分，浓缩上层的乙醇浓度，使脂溶性的黄酮被萃取至上层乙醇中，达到富集的作用。双水相体系的形成，要求乙醇溶液具有较低的pH值。研究发现，在pH值为2的乙醇溶液中加入硫酸铵，超声提取后静置可发生溶液分层，获得双水相体系[16]。采用双水相提取植物中的黄酮较仅采用乙醇提取可大大降低提取成本，节约牛膝菊黄酮的提取成本。硫酸铵用量过低时会在乙醇中完全溶解，导致无法形成双水相；用量过高时，超过饱和状态，将有部分不溶。每1 mL乙醇中含硫酸铵的量在0.20~0.40 g时能够形成稳定的双水相，因此本试验选择硫酸铵用量为0.40 g/mL[13]。4结论本试验采用超声波辅助乙醇-硫酸铵双水相体系对牛膝菊总黄酮进行了提取，并对牛膝菊总黄酮的体外抗氧化作用进行了研究；经Box-Behnken试验设计及响应面法获得了优化的提取工艺。确定采用超声波辅助乙醇-硫酸铵双水相体系提取牛膝菊总黄酮的最优条件为：乙醇浓度34%、提取时间27 min、液料比53 mL/g。在此条件下，3次平行试验加以验证，结果显示牛膝菊总黄酮总提取率5.425%，与模型预测值基本相符。本研究结果表明，所采用的乙醇浓度较低，超声时间较短，可在一定程度上减少溶剂用量，节约能耗，为牛膝菊开发利用方面提供参考。牛膝菊总黄酮具有较强的体外抗氧化作用，其清除羟自由基和超氧自由基的能力与VC相近，有望在临床上发挥抗衰老、抗肿瘤等治疗作用。本研究表明牛膝菊可能作为具有一定药用价值的优良的功能性牧草。