土鸡与肉鸡、蛋鸡相比，具有鸡肉营养价值高、高蛋白低脂肪、肉质细嫩鲜美等优点。近年来，随着人们生活质量的提高和营养保健意识的增强，对土鸡的需求量日益增加。湖南省娄底市拥有丰富的优质土鸡资源。但随着土鸡养殖密度和养殖数量的不断增加，土鸡的免疫力和抗病力不断下降，疫苗免疫失败情况时有发生，土鸡的疫病感染率随之增加[1]。提高土鸡的免疫功能和疫苗免疫效果对推动土鸡养殖产业的稳定与健康发展具有重要意义。中草药作为动物饲料添加剂具有促消化、促生长、抗菌、抗病毒、提高机体免疫力和抗病力等营养保健和药物治疗双重功效[2]，且具有低残留、毒副作用小、价格低廉、无污染、无耐药性等优点[3]。中草药饲料添加剂在动物养殖生产中具有广阔的开发与应用前景[4-5]。目前，关于中草药饲料添加剂在家禽养殖生产中的研究与应用多集中在针对提高肉鸡生长性能、肉品质[2,6]和提高蛋鸡产蛋量、蛋品质等方面[7-8]，其在土鸡饲料添加剂中的研究与应用较少，尤其是在改善土鸡免疫力和抗病力方面还尚未见报道。鉴于此，本研究探讨复方中草药制剂对土鸡免疫功能和疫苗免疫效果的影响，为中草药在土鸡养殖生产中的开发应用提供参考。1材料与方法1.1中草药来源及复方中草药制剂的制备黄芪、丹参、甘草、淫羊藿、白术5味中草药购自北京同仁堂医药公司。将黄芪、丹参、甘草、淫羊藿、白术依次置于37 ℃温箱烘干、粉碎、过200目筛后，以3∶2∶1∶2∶2的比例混合均匀，分装于小袋中密封保存。1.2试验动物、疫苗、诊断抗原120只1日龄健康雪峰乌骨鸡由湘村万乐养鸡合作社提供。鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗（LaSota株+H120株）购自乾元浩生物股份有限公司南京生物药厂；重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗（H5N1 Re-11株+Re-12株、H7N9 Re-2株）、鸡传染性法氏囊病活疫苗（B87株）、鸡新城疫血凝抑制试验抗原（LaSota株）均购自青岛易邦生物工程有限公司。1.3检测试剂盒免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、白介素2（IL-2）、白介素6（IL-6）、γ干扰素（IFN-γ）ELISA试剂盒均购自南京建成生物工程研究所有限公司。1.4试验设计将120只1日龄健康土鸡随机分成4组，每组30只土鸡。对照组饲喂基础日粮，其组成及营养水平见表1，低剂量组、中剂量组、高剂量组分别在基础日粮中添加0.5%、1.0%、2.0%复方中草药制剂。试验土鸡采用散养方式饲养，自由采食与饮水，土鸡疫苗的免疫接种按养殖场常规免疫程序（见表2）进行，试验期为42 d。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.01.001.T001表1基础日粮组成及营养水平（风干基础）原料组成/%1~21日龄22~42日龄营养水平1~21日龄22~42日龄合计100.0100.0玉米60.763.0消化能/(MJ/kg)12.8512.98大豆粕32.028.0粗蛋白/%21.2220.85玉米蛋白粉4.56.0钙/%0.950.89磷酸氢钙1.00.8总磷/%0.550.53石粉0.50.4大豆油0.51.0食盐0.30.3预混料0.50.5注：1.预混料为每千克日粮提供：VA 12 000 IU、VD3 2 500 IU、VB1 2 mg、VB2 5.0 mg、VE 15.0 mg、D-泛酸12 mg、叶酸0.5 mg、 铜8 mg、铁100 mg、锌60 mg、锰50 mg、碘0.3 mg、硒0.2 mg。2.营养水平中消化能为计算值，其余均为实测值。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.01.001.T002表2土鸡免疫程序日龄/d疫苗接种方法接种剂量1鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗滴鼻点眼1羽份7重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗肌肉注射0.5 mL14鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗滴鼻点眼1羽份16鸡传染性法氏囊病活疫苗饮水1.2羽份30鸡传染性法氏囊病活疫苗饮水1.2羽份1.5血清样品的采集试验结束时，利用1.0 mL一次性注射器对所有试验土鸡翅静脉采集血液0.8 mL，将血液全部打入1.5 mL离心管中，将离心管置于37 ℃放置2 h，4 ℃放置4 h后，以5 000 r/min离心10 min，小心吸取上清液于另一个1.5 mL离心管中，即得处理后的血清样品，-20 ℃保存备用。1.6免疫器官的采集在试验结束采集血液后，从每个处理组中随机选择15只土鸡进行屠宰，依次摘取屠宰后土鸡的胸腺、脾脏、法氏囊，并称重。1.7测定指标1.7.1免疫器官指数的测定根据获得的胸腺、脾脏、法氏囊重量，分别计算胸腺指数、脾脏指数、法氏囊指数。免疫器官指数(g/kg)=免疫器官重量(g)/活体重(kg) (1)1.7.2细胞因子含量的测定分别采用IL-2、IL-6、IFN-γ ELISA检测试剂盒依次测定每一只土鸡血清样品中的IL-2、IL-6、IFN-γ含量。1.7.3免疫球蛋白含量的测定采用IgG、IgA、IgM ELISA检测试剂盒测定土鸡血清样品中的IgG、IgA、IgM含量。1.7.4新城疫抗体效价的测定利用鸡新城疫血凝抑制试验抗原，采用常规血凝抑制试验方法测定土鸡血清样品中的鸡新城疫抗体效价（log2）。1.8数据统计与分析数据采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，结果以“平均值±标准差”表示，P＜0.05表示差异显著性。2结果与分析2.1复方中草药制剂对土鸡免疫器官指数的影响（见表3）由表3可知，与对照组相比，中剂量组、高剂量组胸腺指数、脾脏指数、法氏囊指数均显著升高（P＜0.05）。与低剂量组相比，中剂量组胸腺指数显著升高（P＜0.05）。与低剂量组相比，高剂量组胸腺指数、法氏囊指数均显著升高（P＜0.05）。中剂量组与高剂量组各检测指标差异均不显著（P＞0.05）。结果表明，土鸡基础饲粮中添加1.0%和2.0%的复方中草药制剂均能显著提高土鸡的免疫器官指数。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.01.001.T003表3复方中草药制剂对土鸡免疫器官指数的影响项目对照组低剂量组中剂量组高剂量组胸腺指数3.25±0.21a3.32±0.18a3.54±0.20b3.61±0.16b脾脏指数1.12±0.14a1.24±0.16ab1.35±0.14b1.38±0.15b法氏囊指数1.96±0.19a2.01±0.17ab2.15±0.17bc2.18±0.16c注：同行数据肩标相同字母表示差异不显著（P＞0.05），不同字母表示差异显著（P＜0.05）；下表同。g/kg2.2复方中草药制剂对土鸡细胞因子含量的影响（见表4）由表4可知，与对照组相比，低剂量组IL-2含量显著升高（P＜0.05）。与对照组相比，中剂量组、高剂量组IL-2、IL-6、IFN-γ含量显著升高（P＜0.05）。与低剂量组相比，中剂量组IL-2、IL-6含量显著升高（P＜0.05）。与低剂量组相比，高剂量组IL-2、IL-6、IFN-γ含量均显著升高（P＜0.05）。中剂量组与高剂量组各检测指标差异均不显著（P＞0.05）。结果表明，土鸡基础饲粮中添加0.5%、1.0%和2.0%的复方中草药制剂均能显著提高土鸡血清中的免细胞因子含量，1.0%和2.0%添加剂量的作用效果显著好于0.5%添加剂量的作用效果。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.01.001.T004表4复方中草药制剂对土鸡细胞因子含量的影响项目对照组低剂量组中剂量组高剂量组IL-288.65±1.24a91.56±1.32b95.14±1.28c96.54±1.31cIL-6168.54±2.54a169.24±2.45a172.36±2.41b173.85±2.48bIFN-γ42.57±1.11a43.42±1.21ab44.35±1.19bc44.87±1.17cng/L2.3复方中草药制剂对土鸡免疫球蛋白含量的影响（见表5）由表5可知，与对照组相比，低剂量组IgG含量显著升高（P＜0.05）。与对照组相比，中剂量组、高剂量组IgG、IgA含量均显著升高（P＜0.05）。与低剂量组相比，高剂量组IgG含量显著升高（P＜0.05）。中剂量组与高剂量组各检测指标差异均不显著（P＞0.05）。结果表明，土鸡基础饲粮中添加0.5%、1.0%和2.0%的复方中草药制剂均能显著提高土鸡的免疫球蛋白含量，2.0%添加剂量的作用效果显著好于0.5%添加剂量的作用效果。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.01.001.T005表5复方中草药制剂对土鸡免疫球蛋白含量的影响项目对照组低剂量组中剂量组高剂量组IgG1.52±0.18a1.75±0.21b1.84±0.19bc1.97±0.19cIgA0.95±0.08a0.99±0.10ab1.06±0.10b1.08±0.10bIgM0.81±0.060.82±0.060.84±0.080.84±0.08g/L2.4复方中草药制剂对土鸡新城疫抗体效价的影响（见表6）由表6可知，与对照组相比，低剂量组、中剂量组、高剂量组新城疫抗体效价均显著升高（P＜0.05）。与低剂量组相比，中剂量组、高剂量组新城疫抗体效价均显著升高（P＜0.05）。高剂量组和中剂量组新城疫抗体效价差异不显著（P＞0.05）。结果表明，土鸡基础饲粮中添加0.5%、1.0%和2.0%的复方中草药制剂均能显著提高土鸡的新城疫抗体效价，1.0%和2.0%添加剂量的作用效果显著优于0.5%添加剂量，1.0%和2.0%添加剂量之间无显著性差异。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.01.001.T006表6复方中草药制剂对土鸡新城疫抗体效价的影响项目对照组低剂量组中剂量组高剂量组新城疫抗体效价5.53±0.64a6.33±0.49b7.13±0.35c7.47±0.52clog23讨论当前土鸡疫病综合防控技术的发展相对滞后，导致当前土鸡养殖中疫病发生率居高不下。提高土鸡自身的免疫功能和疫苗免疫效果，降低疫病的发生率对保障土鸡健康和养殖经济效益至关重要。中草药作为饲料添加剂具有提高免疫力、抗应激、抗菌、抗病毒等功效，同时兼顾营养保健和药物治疗的功效。陶剑等[9]研究3种中草药制剂分别对断奶仔猪生长性能、免疫、抗应激及抗氧化能力的影响，结果表明，3种中草药对仔猪的生长发育均有促进作用。由桑叶、菊花、蒲公英、连翘、薄荷、苦杏仁组成的中草药复方能够显著提高断奶仔猪的免疫力，由陈皮、金银花、鱼腥草、麦冬、知母组成的中草药复方能够显著提高断奶仔猪的抗应激能力。夏玉芬等[10]研究表明，舍饲藏羊基础饲粮中添加由山楂、党参、板蓝根、甘草、野菊花、陈皮、柴胡、杜仲、何首乌、黄芪组成的复方中草药能够显著提高舍饲藏羊的免疫球蛋白含量和细胞因子含量，提高舍饲藏羊的免疫功能。本研究根据中兽医的组方原则，综合选择黄芪、丹参、甘草、淫羊藿、白术5味中草药合理配伍制备中草药复方制剂，其中黄芪具有保肝利尿、抗应激、抗细胞衰老、增强免疫力之功效；丹参具有活血、养血、安神之功效；甘草具有清热解毒、凉血利咽之功效；淫羊藿具有补肝肾、强筋骨之功效；白术具有益气健脾、润肠通便之功效。理论上该复方制剂能够提高土鸡的食欲，提高营养物质的消化吸收利用率，促进免疫器官的发育，提高淋巴细胞转化率，进而提高土鸡的免疫功能。本研究结果表明，土鸡基础日粮中添加1.0%和2.0%的该复方制剂可显著改善土鸡的免疫器官指数，提高土鸡血清中的细胞因子和免疫球蛋白含量，提高新城疫抗体效价。免疫器官指数可在一定程度上体现机体免疫器官功能的强弱[2]。细胞因子含量可在一定程度上体现机体细胞免疫应答反应的强弱[11]。免疫球蛋白含量可在一定程度上体现机体体液免疫应答反应的强弱[12]。新城疫抗体效价可在一定程度上直接体现新城疫疫苗的免疫效果[13]。本研究结果表明，土鸡基础日粮中添加1.0%和2.0%的该复方制剂可显著提高土鸡的免疫功能和新城疫疫苗免疫效果。本研究发现，复方中草药制剂1.0%和2.0%添加剂量的作用效果显著优于0.5%添加剂量的作用效果。1.0%和2.0%添加剂量的作用效果无显著性差异，表明土鸡对复方中草药制剂的吸收利用有一个最适需要量，添加超过这个需要量的多余复方中草药制剂不能被土鸡完全吸收利用。由于受到中草药来源与纯度、土鸡品种与日龄、饲养管理水平等方面差异的影响，不同种类土鸡对中草药的最适需要量也存在较大差异。4结论本试验条件下，土鸡基础饲粮中添加1.0%和2.0%的复方中草药制剂能够显著提高土鸡的免疫功能和新城疫疫苗免疫效果，提高土鸡的免疫力和抗病力，建议临床应用中添加剂量为1.0%。