紫花苜蓿又称“牧草之王”,因具有优良品质与极高的营养价值在世界各地广泛种植。紫花苜蓿在秋季会产生休眠现象,这种现象严重影响了产草量、刈割茬次。紫花苜蓿的秋眠性与抗寒性联系紧密,二者呈显著正相关,但两者又是两个相对独立的性状。抗寒性是植物长期物种进化过程中形成的抵抗环境应激的应对机制,也是影响苜蓿冬季生长水平和抵抗冻害能力的重要因素。苜蓿种类分为秋眠型(1~3级)、半秋眠型(4~6级)和非秋眠型(7~9级)[1],后来又在此基础上扩展至11个秋眠等级,即秋眠型(1~4级)、半秋眠型(5~7级)和非秋眠型(8~11级),秋眠型品种一般抗寒能力较强,非秋眠型品种抗寒能力较弱,二者呈正相关[2-3]。在低温条件下,可溶性糖作为一种抗寒保护物质[4],非结构性碳水化合物与多种植物的抗寒性相关[5],蔗糖是影响紫花苜蓿抗寒性和越冬率的关键因素[4]。秋季和冬初苜蓿中淀粉含量明显减少,可溶性糖类尤其是蔗糖明显增多[6]。蔗糖在高等植物中具有重要作用,在植物生长发育不同阶段均发挥调节作用。蔗糖是光合作用的主要产物和植物体内糖类运输的主要形式,细胞内代谢调节的过程中受到其基因表达的影响[7]。苜蓿根中糖积累的浓度与品种间的抗逆性存在一定相关性[8-12]。研究发现,当温度降低时,由于淀粉分解速度的加快会造成可溶性糖含量增多,呈逐渐上升趋势,耐寒性品种的可溶性糖含量上升幅度更为明显[13]。α-淀粉酶、β-淀粉酶可以将淀粉分解为可溶性糖类,有助于提高植物细胞内可溶性糖含量。在低温条件下,可溶性糖可以通过提高细胞液的浓度和细胞的渗透调节能力维持细胞膜的稳定,提高自身的抗寒能力。细胞中可溶性糖可与水结合,增强原生质层的黏性,束缚自由水,从而提高细胞抗结冰脱水的能力[14-16]。植物抗逆性是植物为适应不良环境形成的一种生理特性,由于受基因控制而合成酶。而酶、代谢以及生理功能的调节又影响其基因表达。因此,推断苜蓿秋眠的调控可能有淀粉酶的参与。目前的研究多关注可溶性糖参与苜蓿抗寒调控,但关于可溶性糖特别是淀粉酶是否参与紫花苜蓿秋眠调控的研究较少。本试验通过研究秋眠品种和非秋眠品种各月份叶片中α-淀粉酶和β-淀粉酶的酶活及其mRNA表达,探讨二者在苜蓿秋眠调控中的作用,为研究紫花苜蓿秋眠的调控与淀粉酶代谢间的关系提供参考。1材料与方法1.1试验材料试验分别选择在自然条件下培育的4个紫花苜蓿标准品种。秋眠型紫花苜蓿标准品种:秋眠1级Maverick(FDC1)、秋眠2级Vernal(FDC2)、秋眠10级UC-1887(FDC10)、秋眠11级UC-1465(FDC11)。试验材料种植于原阳苜蓿试验基地,按期收割,14 d取样,按照3月、4月、6月、7月、9月不同的月份采摘,采摘在每月下旬10:00,摘取苜蓿叶片第三片真叶,测定酶活力和淀粉酶基因表达量。1.2测定指标及方法1.2.1淀粉酶活力称取约0.1 g苜蓿叶片样本,制备淀粉酶原液和相应的淀粉酶稀释液,用于测定α-淀粉酶+β-淀粉酶总活力,检测和计算方法按照南京建成生物有限公司的植物α-淀粉酶试剂盒和总淀粉酶试剂盒说明进行。1.2.2苜蓿叶片总RNA的提取及反转录总RNA提取采用试剂盒(Takara公司),使用Nano Drop 2000紫外分析仪测定RNA浓度及OD值。反转录反应液的配制以及其反应条件包括:缓冲液5 μL、25 mmol/L硫酸镁2 μL、DNA聚合酶的底物(10 mmol/L)0.5 μL、RNA酶抑制剂RNase Inhibitor(40 U/μL)0.25 μL、无酶水0.75 μL、反转录酶(22 U/μL)0.5 μL、随机引物0.5 μL、阳性对照RNA 0.5 μL,共10 μL。1.2.3GAPDH、α-淀粉酶、β-淀粉酶基因引物设计引物序列见表1。GAPDH参考文献[17],α-淀粉酶和β-淀粉酶根据NCBI上查到的苜蓿基因序列为模板[18],通过Primer 5.0设计。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.014.T001表1引物序列名称碱基序列(5'→3')扩增长度/bp扩增温度/℃β-amylase-FTCAGGATTACTGTTCGGAC11655β-amylase-RAACGGCGGTATTGGCTTAGα-amylase-FCAAGTGGGCATCAAGTGAA10558α-amylase-RGGAGGAGGAAGCCAAACAGAPDH-FTGTGCCAATCTATGAGGGTT13155GAPDH-RTCTTTTGGATTGGGCTTCGT1.2.4α-淀粉酶基因和β-淀粉酶基因表达量PCR反应体系:PCR上游引物(10 μmol/L)0.5 μL、PCR下游引物(10 μmol/L)0.5 μL、荧光染料(50×)0.5 μL、SYBR Premix Ex TaqTM(2×)10.0 μL、DNA模板2.0 μL、无酶水6.5 μL、20 μL反应体系。反应参数为95 ℃ 30 s预变性,95℃ 5 s,β-淀粉酶55℃ 30 s(α-淀粉酶58 ℃ 30 s),共35个循环。扩增完成进行熔解曲线分析,94 ℃ 1 min,60 ℃ 1 min,以0.10 ℃/s的速度升温至92 ℃,连续荧光监测,记录每个样品和GAPDH的CT值,结果以2-∆∆Ct计算[19]。1.3数据统计与分析试验设计4个紫花苜蓿标准品种,每个品种3个重复,所有数据的统计分析采用SPSS 23.0软件。2结果与分析2.1不同秋眠型紫花苜蓿α-淀粉酶、β-淀粉酶酶活(见表2、表3)由表2可知,3月和7月秋眠品种Maverick叶片中α-淀粉酶酶活显著高于4月、6月、9月(P0.05);3月秋眠品种Vernal叶片中α-淀粉酶酶活显著高于其他月份,7月显著高于4月(P0.05)。9月非秋眠品种UC-1887叶片中α-淀粉酶酶活显著高于3月、4月、6月,7月显著高于4月、6月(P0.05);4月和6月非秋眠品种UC-1465叶片中α-淀粉酶酶活显著高于3月(P0.05)。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.014.T002表2不同秋眠型紫花苜蓿叶片中α-淀粉酶酶活品种3月4月6月7月9月Maverick6.19±0.43a4.33±0.16b4.82±0.70b5.85±0.13a4.97±0.57bVernal6.96±0.23a4.85±0.34c5.33±0.22bc5.34±0.24b5.24±0.28bcUC-18874.88±0.76bc4.86±0.13c4.23±0.22c5.87±0.80ab8.21±0.44aUC-14654.88±0.39b5.63±0.22a5.53±0.21a5.32±0.35ab5.34±0.40ab注:同行数据肩标不同字母表示同品种(品系)不同月份间差异显著(P0.05);下表同。U/g由表3可知,3月和9月品种Maverick叶片中β-淀粉酶酶活显著高于6月(P0.05);3月秋眠品种Vernal叶片中β-淀粉酶酶活显著高于其他月,9月显著高于4月、6月、7月(P0.05)。9月非秋眠品种UC-1887叶片中β-淀粉酶酶活显著高于其他月份(P0.05)。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.014.T003表3不同秋眠型紫花苜蓿叶片中β-淀粉酶酶活品种3月4月6月7月9月Maverick22.99±2.03a19.52±1.65ab19.38±1.21b20.35±2.70ab22.88±1.58aVernal25.67±1.69a16.48±0.66c18.33±0.69c18.86±2.39c22.40±2.00bUC-188719.54±2.82b16.57±0.57b18.24±2.14b18.88±0.88b26.00±1.10aUC-146518.37±1.3018.52±1.6621.43±3.7621.09±1.4622.60±3.34U/g2.2不同秋眠型紫花苜蓿叶片中淀粉酶基因表达量(见表4、表5)将大肠杆菌菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司检测。使用NCBI上的工具BLAST将检测结果加以对照分析,表明所得序列为预期片段。通过测定不同月份α-淀粉酶、β-淀粉酶mRNA表达量衡量其基因表达水平。由表4可知,3月和4月的Vernal、UC-1887、UC-1465品种叶片中α-淀粉酶的基因表达量显著低于其他月,除Maverick的4月、9月和UC-1465的4月外,4个苜蓿品种中α-淀粉酶基因的表达量均存在随月份而逐渐升高的趋势。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.014.T004表4不同月份紫花苜蓿叶片中α-淀粉酶基因表达量品种3月4月6月7月9月Maverick1.00±0.19b0.73±0.20b9.25±1.55a9.71±0.62a9.13±1.10aVernal0.91±0.15c3.43±0.44c8.69±1.29b10.48±1.56b14.47±0.84aUC-18870.92±0.19d2.89±0.35c6.99±0.62b9.13±0.82a9.68±0.50aUC-14651.22±0.08d0.95±0.40d5.24±1.23c8.00±0.41b11.24±1.15a由表5可知,3月秋眠品种Maverick叶片中β-淀粉酶基因的表达量显著低于4月、7月、9月(P0.05);3月秋眠品种Vernal叶片中β-淀粉酶基因的表达量显著低于其他月(P0.05);4月显著低于6月、7月、9月(P0.05)。3月和4月非秋眠品种UC-1887叶片中β-淀粉酶基因的表达量显著低于6月、7月、9月(P0.05);3月和4月非秋眠品种UC-1465叶片中β-淀粉酶基因的表达量显著低于7月、9月(P0.05);除Maverick的4月和UC-1887的9月外,4个苜蓿品种中β-淀粉酶基因表达量均存在随月份增加而逐渐增加的趋势。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.014.T005表5不同月份紫花苜蓿叶片中β-淀粉酶基因表达量品种3月4月6月7月9月Maverick1.00±0.16b1.69±0.39a1.49±0.24ab1.75±0.22a1.95±0.29aVernal0.85±0.15c1.36±0.14b2.01±0.15a2.10±0.11a2.27±0.31aUC-18871.60±0.14c1.68±0.13c5.24±0.45a6.63±1.05a3.95±0.37bUC-14650.91±0.21c1.15±0.17c2.28±0.20ab3.14±0.69b7.63±1.29a2.3紫花苜蓿叶片α-淀粉酶、β-淀粉酶基因表达量与酶活的综合比较分析(见表6)由表6可知,4种紫花苜蓿叶片中的α-淀粉酶、β-淀粉酶基因表达量和酶活的相关性均未达到显著水平,α-淀粉酶、β-淀粉酶基因表达量和秋眠结束后生长时间呈正相关,而秋眠品种紫花苜蓿叶片中α-淀粉酶活、β-淀粉酶活和抗逆性能相关。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.014.T006表6两种淀粉酶基因表达量与酶活的相关系数淀粉酶相关系数MaverickVernalUC-1887UC-1465α-淀粉酶0.007-0.5330.6210.108β-淀粉酶-0.194-0.3730.110.8453讨论紫花苜蓿的秋眠性是随着环境变化而发生的一种适应性生长特性,在秋季为应对光照长度变短和气温降低的一种适应性生理特性。在寒冷环境中苜蓿也会通过代谢反应应对周围环境对自身所造成的伤害,苜蓿的秋眠性和抗寒性均是影响苜蓿冬季生长水平和抗寒耐冻能力的重要因素,虽然是两个相对独立的性状,但二者关系具有很高的相关性[20]。宋吉仁[21]研究发现,抗寒作物体内叶绿体在非寒冷期前会有淀粉粒的积累,而寒冷时期淀粉粒的数量明显减少,抗性较弱的品种则正好相反。方强恩等[22]在越冬期间对紫花苜蓿根茎芽幼叶细胞扫描中发现,淀粉粒减少甚至消失等生理活动,从而提高根茎芽的抗寒能力。在低温条件下,植物光合作用不能维持根中糖类的浓度,淀粉在淀粉酶作用下分解成可溶性糖用于维持细胞渗透压,增强植物细胞的渗透调节能力[23],可溶性糖含量与紫花苜蓿的越冬率高度相关[11]。段念[24]发现,枳β-淀粉酶能够将淀粉分解成为可溶性糖类,提高细胞中可溶性糖类的浓度,保护光合电子传递链和叶绿体基质蛋白从而增强植株的抗性。王丹等[25]研究发现,耐寒植物结缕草在寒冷季节地下根茎中的淀粉含量呈降低后升高的趋势,而植物细胞内可溶性糖呈先升高后降低的趋势。在冷胁迫条件下,根系中总糖水平升高伴随淀粉水平的降低,对抗性品种淀粉酶浓度表现最低但糖浓度却最高[26]。与本试验研究结果一致,秋眠品种紫花苜蓿叶片中α-淀粉酶活性、β-淀粉酶活性在寒冷月份(3月)也表现出较高的水平,参与了植物抗寒性调节的过程。基因表达是指细胞在生命过程中把储存在DNA顺序中的遗传信息经过转录和翻译,转变为具有生物活性的蛋白质分子。就是从DNA—mRNA—蛋白的过程,通过转录mRNA的量可以反映该基因的表达水平。每个基因转录产生mRNA的量是受多种因素调节的,在不同的阶段或组织水平基因转录出mRNA的量都是不同的。研究发现,在植物休眠的过程中α-淀粉酶和β-淀粉酶的分解产物有一定的调控能力,如大戟科乳浆草在相对休眠的状态下进入秋眠状态时,β-淀粉酶mRNA的表达量增大了16 000倍[27],适当的盐胁迫会使其种子之中的α-淀粉酶的表达量得到提高[28]。周国雁等[29]研究发现,随着贮藏种子温度上升,种子α-淀粉酶活性与基因相对表达关系也从不显著变为显著或极显著相关性,低温时二者无明显相关性。4结论秋眠型紫花苜蓿品种Maverick与Vernal在3月(低温)α-淀粉酶和β-淀粉酶酶活呈上升趋势,非秋眠型品种则无明显趋势,表明秋眠型品种的抗寒性更强。α-淀粉酶、β-淀粉酶基因表达量随着月份有逐渐升高的趋势,但α-淀粉酶、β-淀粉酶酶活和基因表达量不存在明显相关性。
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