构树（Broussonetia papyrifera）又称壳树、褚树等，为多年生落叶乔木，营养价值高，具有一定的饲用、药用价值。研究发现，构树叶中粗蛋白质含量超过20%[1]，可与苜蓿媲美，而全株构树枝叶粗蛋白质含量达12.63%[2]。构树具有适应性强、耐贫瘠、耐刈割、耐干冷、耐湿热、根系发达等特点，是一种极具开发价值的非常规饲料资源。2018年4月农业农村部已将构树列入《饲料原料目录》。近年来，我国加大了规模化推广种植杂交构树力度，“十三五”期间我国杂交构树种植面积将超过500万hm2[3]。通过微生物发酵技术对全株构树进行加工利用，添加或代替部分日粮饲喂猪、羊、奶牛等，动物均表现出较好的生产性能[4-5]。构树作为新型饲料原料在缓解我国畜牧业蛋白质饲料资源紧缺、改善畜产品品质风味、降低养殖成本等方面具有巨大潜力。在养殖过程中，常有采摘鲜构树枝叶饲喂家畜的习惯，但由于构树枝叶蛋白质分子等营养结构复杂，含有较高纤维素、半纤维素和木质素，导致动物适口性差、采食减少，畜禽食用后消化吸收利用率不高。因此，合理的青贮发酵构树是保持其品质的前提。构树的干物质和可溶性碳水化合物含量较低，直接青贮较难成功，而添加外源益生菌是改善青贮品质最为便捷和有效的方式[6]。米曲霉（Aspergillus oryaze）是一种好气性益生真菌，其菌株可产纤维素酶、糖化酶、植酸酶、蛋白酶和淀粉酶等复合酶[7]。米曲霉已经是联合国粮农组织和世界卫生组织公认安全的食品级菌种，米曲霉微生物产品可以直接饲喂动物[8]。本试验使用米曲霉青贮发酵构树，采用仿生消化法，气相色谱-质谱联用法，考察构树青贮发酵品质、营养成分、氨基酸、干物质消化率、总能消化率和酶水解物能值等关键营养参数的变化，为合理开发构树作为畜禽饲料提供参考。1材料与方法1.1试验材料试验构树采自广西南宁周边，人工收割枝叶长约1 m。9ZF5型铡草揉丝机揉搓粉碎约1~3 mm。新鲜构树枝叶营养成分见表1。新鲜构树枝叶氨基酸含量见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.022.T001表1新鲜构树枝叶营养成分项目干物（DM）/%粗蛋白（CP）/%酸性洗涤纤维（ADF）/%中性洗涤纤维（NDF）/%可溶性碳水化合物/(g/100 g)总能（GE）/(kJ/g)含量40.3410.3234.0342.351.7516.1710.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.022.T002表2新鲜构树枝叶氨基酸含量非必需氨基酸（NEAA）含量必需氨基酸（EAA）含量总氨基酸（TAA）7.611天门冬氨酸（Asp）0.887苏氨酸（Thr）0.470酪氨酸（Tyr）0.302缬氨酸（Val）0.417丝氨酸（Ser）0.464蛋氨酸（Met）0.060谷氨酸（Glu）0.810异亮氨酸（Ile）0.397甘氨酸（Gly）0.710亮氨酸（Leu）0.558丙氨酸（Ala）0.526苯丙氨酸（Phe）0.328胱氨酸（Cys）0.083赖氨酸（Lys）0.369脯氨酸（Pro）0.452组氨酸（His）0.184氨基酸态氮（NH3）0.223精氨酸（Arg）0.371TNEAA4.457TEAA3.154%发酵菌剂：米曲霉为实验室选育；复合菌剂由枯草芽孢杆菌（56.0×108 CFU/g）、沼泽红假单胞菌（20×108 CFU/g）组成（南宁某生物科技有限公司）。1.2培养基配置及接种液计数高盐察氏培养基：称取本产品109 g，加热溶解于1 000 mL蒸馏水中，分装，115 ℃高压灭菌30 min。米曲霉活化及菌落计数使用高盐察氏培养基。采用血球计数法计算米曲霉孢子浓度，经计算米曲霉（XMS01）菌液浓度为6.5×107 CFU/mL。1.3试验设计试验分3组，每组3次重复，每个重复3 kg构树枝叶。试验设计见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.022.T003表3试验设计组别添加菌剂种类添加量（鲜样基础）对照组——试验Ⅰ组复合菌剂300 mL试验Ⅱ组米曲霉30 g注：“—”表示无添加。1.4青贮制作按各组所需青贮菌剂分别溶于300 mL蒸馏水中，喷洒至粉碎揉搓好的构树枝叶原料中，搅拌均匀，对照组添加等体积蒸馏水，使用带单向出气阀薄膜饲料袋打包压实，密封，青贮。避光室内青贮发酵40 d。1.5测定指标及方法1.5.1常规指标分析发酵样品在干燥箱65 ℃烘48 h，粉碎，过40目筛，制成检测样品。参照杨胜[9]方法测定营养成分指标。采用TM8400型凯氏定氮仪测定粗蛋白（CP）含量；TM8000型全自动纤维分析仪测定中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）含量；5E-AC8018型等温式全自动量热仪测定总能（GE）；LA8080全自动氨基酸分析仪（日本日立公司）测定氨基酸含量。1.5.2发酵品质分析1.5.2.1样品采集构树青贮开封，混匀样品，每袋准确称取35 g样品，放入250 mL广口瓶中，加150 mL超纯水，搅匀，4 ℃冰箱放置24 h，使用2层纱布过滤，分装滤液，用于测定pH值、乳酸、氨态氮、挥发性脂肪酸（VFA）含量。1.5.2.2发酵指标使用PHS-3C pH计（上海雷磁）测定pH值；采用苯酚-次氯酸钠比色法测定氨态氮含量[10]。称取样品20 mg解冻，置于EP管中，加入1 mL磷酸（0.5%）溶液，20 Hz下球仪10 s，15 000 r/min涡旋10 min，4 ℃离心15 min，取200 μL上清液。采用气相色谱-质谱联用法[11]测定挥发性脂肪酸（VFA）（乙酸、丁酸、丙酸等）含量。采用GB/T 27985-2011蒽酮-硫酸比色法测定[12]可溶性碳水化合物（WSC）含量。1.5.3仿生消化分析采用仿生消化系统（SDS-III）测定干物质消化率、总能消化率和酶水解物能值，仿生消化操作过程和计算方法参照仿生消化系统（SDS-III)[13]。1.5.4青贮饲料感官评定青贮开封后根据《青贮饲料质量评定标准（试行）》进行感官评定[14]，以色泽、质地、气味及霉变情况等进行现场评定。1.6数据统计与分析采用Excel及SPSS 17.0软件对试验数据进行处理与分析，LSD法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1米曲霉对构树青贮感官评定结果的影响（见表4）由表4可知，总分排序：试验Ⅱ组试验Ⅰ组对照组。试验Ⅰ组、试验Ⅱ组构树青贮的感官评定等级均为优，对照组感官评定等级为良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.022.T004表4米曲霉对构树青贮感官评定结果的影响组别气味气味评分色泽色泽评分质地质地评分pH值pH值评分总分等级对照组淡酸味16深绿色9松散软弱、水分较重、略有成团且粘手84.97841良试验Ⅰ组甘酸味18绿色10松散软弱、水分合适、不粘手95.81643优试验Ⅱ组甘酸味18绿色10松散软弱、水分合适、不粘手104.471048优2.2米曲霉对构树青贮发酵品质的影响（见表5）由表5可知，试验Ⅱ组构树青贮pH值显著低于对照组（P0.05）；LA含量显著高于对照组（P0.05），比对照组、试验Ⅰ组分别提高23.39%、103.94%；NH3-N、AA、BA含量显著低于对照组（P0.05）；各组丙酸含量差异均不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.022.T005表5米曲霉对构树青贮发酵品质的影响组别pH值乳酸（LA）/(μmol/g)氨态氮（NH3-N）/(g/mL)乙酸（AA）/(mg/g)丁酸（BA）/(mg/g)丙酸（PA）/(mg/g)对照组4.97±0.45b100.23±7.46b5.49±0.29a7.63±0.74a5.59±0.60a2.25±0.12试验Ⅰ组5.81±0.08a60.60±13.14c4.80±1.13ab4.63±0.29b4.54±3.62ab3.10±0.30试验Ⅱ组4.47±0.10c123.67±9.66a4.06±0.22b2.03±0.29c1.35±0.11b3.35±0.47注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表6、表8与此同。2.3米曲霉对构树青贮主要营养成分的影响（见表6）由表6可知，各组间构树鲜样DM、CP含量和GE差异不显著（P0.05）；试验Ⅱ组构树青贮的ADF和NDF含量显著低于其他组（P0.05）；试验Ⅰ组、Ⅱ组构树青贮的WSC含量显著高于对照组（P0.05），其中试验Ⅱ组构树青贮的WSC含量最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.022.T006表6米曲霉对构树青贮主要营养成分的影响组别鲜样DM/%CP/%ADF/%NDF/%WSC/(g/100 g)GE/(kJ/g)对照组39.26±0.1110.21±0.3333.50±0.71a41.77±2.49ab2.01±1.02c16.29±0.03试验Ⅰ组38.69±0.3310.70±0.2133.56±0.43a42.53±0.98a2.47±0.25b16.49±0.04试验Ⅱ组38.82±0.1910.75±0.2830.16±1.14b38.46±1.07b2.85±2.04a16.37±0.132.4米曲霉对构树青贮氨基酸含量的影响（见表7）由表7可知，试验Ⅱ组构树青贮的TAA及EAA含量最高，显著高于对照组（P0.05），试验Ⅰ组次之，对照组最低；试验Ⅱ组构树青贮的EAA/TAA以及EAA/NEAA比值最高，显著高于对照组和试验Ⅰ组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.022.T007表7米曲霉对构树青贮氨基酸含量的影响项目对照组试验Ⅰ组试验Ⅱ组NEAA/%Asp0.742±0.010b0.696±0.018c0.841±0.009aTyr0.191±0.014b0.226±0.016a0.245±0.012aSer0.488±0.011c0.601±0.012a0.515±0.009bGlu0.816±0.016a0.691±0.012c0.725±0.012bGly0.513±0.0110.495±0.0090.510±0.010Ala0.675±0.008a0.615±0.004b0.615±0.009bCys0.141±0.009b0.197±0.011a0.095±0.008cPro0.749±0.0170.642±0.0190.701±0.009氨基酸态氮（NH3）0.418±0.0100.295±0.0140.373±0.010EAA/%Thr0.345±0.012b0.380±0.020a0.321±0.012bVal0.277±0.0130.549±0.0170.546±0.022Met0.115±0.009a0.076±0.008b0.127±0.009aIle0.447±0.0280.416±0.0130.419±0.015Leu0.759±0.018a0.704±0.005b0.699±0.011bPhe0.481±0.0090.454±0.0300.454±0.008Lys0.467±0.011a0.447±0.021b0.567±0.013aHis0.172±0.013ab0.157±0.009b0.182±0.012aArg0.280±0.0120.388±0.0100.326±0.016∑NEAA/%4.768±0.0804.708±0.0754.754±0.062∑EAA/%2.891±0.035b3.027±0.052a3.133±0.088aTAA/%7.659±0.012b7.735±0.127ab7.887±0.150aEAA/TAA0.377±0.002c0.391±0.000b0.397±0.004aEAA/NEAA0.606±0.005c0.643±0.001b0.659±0.010a注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。2.5米曲霉对构树青贮主要养分消化率的影响（见表8）由表8可知，试验Ⅱ组构树青贮的干物质消化率显著高对照组（P0.05）；试验Ⅱ组构树青贮能量及酶水解能值消化率最高，试验Ⅰ组次之，对照组最低。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.022.T008表8米曲霉对构树青贮主要养分消化率的影响组别干物质消化率/%能量消化率/%酶水解能值/（MJ/kg）对照组29.82±0.10b36.00±1.406.53±0.25试验Ⅰ组29.72±0.04b36.52±0.086.64±0.71试验Ⅱ组33.17±0.10a36.98±0.216.69±0.143讨论3.1米曲霉对构树青贮感官评定结果的影响本试验中，依据气味、色泽、质地及pH值打分，发现对照组构树水分较重，上层发生少量霉变、略有成团且粘手；试验Ⅱ组和试验Ⅰ组构树无霉变情况，其他评定指标的分值相对较高，品质优于对照组，表明添加相关米曲霉、枯草芽孢杆菌等微生物制剂等有利于改善构树青贮发酵品质。王启芝等[15]研究发现，甘蔗尾叶青贮添加生物制剂后，感官评定总分为76~78，高于自然发酵组69~73分，与本试验研究结果一致。3.2米曲霉对构树青贮发酵品质的影响青绿饲料在厌氧的发酵环境中，通过自有的乳酸菌或外界添加一些有益的微生物，经过益生菌的生长发酵活动，产生乙酸、丁酸和丙酸等挥发性脂肪酸，青贮饲料的pＨ值降低，抑制其他有害微生物生长，达到长期保存青绿饲料的目的[16]。pH值作为青贮饲料发酵品质评定的一个重要指标，能够反映青贮品质，一般青贮pH值≤4.2，青贮饲料质量为优；pH值4.2~4.5，青贮饲料质量为中等；pH值4.5~5.0，青贮饲料质量为一般；pH值≥5.1，青贮饲料质量为劣[17]。本研究中，3组构树青贮后的pH值均在4.40以上。原因是构树缓冲能值较高，不利于pH值的降低。本试验中，试验Ⅱ组构树青贮的pH值显著低于其他组；乳酸含量显著高于其他组，表明试验Ⅱ组构树青贮品质优于其他组，可能是由于接种的米曲霉发酵产生的非淀粉多糖酶可降解构树的非淀粉多糖，产生的大量单糖可以被乳酸菌所利用，从而产生更多的乳酸，使pH值快速下降[18]，抑制了青贮过程中植物蛋白酶和其他杂菌对蛋白质和氨基酸的降解作用。氨态氮含量是检测青贮饲料品质的一个重要指标，能够反映饲料在青贮过程中蛋白质被破坏程度，青贮饲料开窖后氨态氮含量越低，表明青贮饲料的品质越佳。本研究中，试验Ⅱ组构树青贮的氨态氮含量比对照组有所降低，表明蛋白质被破坏程度低或者是合成菌体蛋白的能力增强。青贮饲料中丁酸梭菌发酵饲料原料而产生丁酸，其含量越少，表明青贮饲料的品质越高。试验Ⅱ组构树青贮有益代谢产物较为丰富，结构优良，表明米曲霉对构树发酵品质的提高具有显著作用。3.3米曲霉对构树青贮主要营养成分的影响本试验中，各组间构树青贮的干物质、粗蛋白和能量差异不显著，但试验Ⅱ组和试验Ⅰ组构树青贮的粗蛋白含量比自然青贮组提高了5.29%、4.70%，可能是构树原料中的碳水化合物和CP等营养成分会被有益微生物的生长消耗，生成大量微生物核酸和菌体蛋白大分子等物质，随着青贮发酵时间的延长，青贮饲料中结合水和部分DM会以气体等形式损失且含量的减少，从而使青贮饲料开窖后CP含量相对增加。本试验中，试验Ⅱ组构树的酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维含量显著低于对照组。米曲霉是一类产复合酶的益生菌，主要通过分泌蛋白酶、糖化酶、纤维素酶等酶类对原料中的多糖、纤维素等大分子物质进行降解，使得纤维类物质降解成小分子单糖，提高发酵制品的品质[19]。3.4米曲霉对构树青贮氨基酸含量的影响必需氨基酸含量能够决定饲料中蛋白质品质。本研究表明，添加外源益生菌能够在一定程度上提高构树枝叶EAA、TAA含量，其中试验Ⅱ组显著高于试验Ⅰ组，试验Ⅱ组EAA/TAA以及EAA/NEAA比值最高，试验Ⅰ组次之，对照组最低。陈姣姣等[20]研究表明，以苹果渣为主料及以苹果渣+玉米浆为原料，以酵母菌+黑曲霉为发酵剂，发酵产物氨基酸总量比对照组分别增加83.1%、83.2%，2种复合发酵剂均能较大幅度提高苹果渣发酵产物氨基酸总量及水溶性氨基酸含量，与本试验结果基本一致。3.5米曲霉对构树青贮干物质消化率、能量消化率和酶水解能值的影响体外法可以快速评价益生菌发酵饲料的有效性。仿生消化系统（SDS-Ⅲ）是由电脑程控模型控制模拟饲料在畜禽体内消化过程，能够最大限度地减少由于人工操作产生的系统误差，测试的酶水解物能值与动物体内值具有较高的相关性和重演性[14]，仿生消化法为高纤维粗饲料原料代谢能的测定提供了一种新的评定方法。本试验仿生消化法测定试验结果显示，试验Ⅱ组构树青贮的干物质消化率、能量消化率和酶水解能值均有不同程度提高，与马剑青等[21]在肉鸡日粮中添加米曲霉对粗蛋白和能量消化率的结果基本一致。构树中含有丰富的纤维素、半纤维素和木质素，还含有抗营养因子（单宁、胰蛋白酶抑制因子），畜禽消化道中缺乏消化上述物质的消化酶，借助米曲霉发酵产生的复合酶可以提高对上述物质的消化吸收，从而提高包裹在细胞壁内的蛋白质、矿物质的释放与消化[22-23]。4结论在构树青贮过程中添加米曲霉可提高发酵品质和营养价值，在一定程度上提高了构树的养分消化率。