珍珠龙胆石斑鱼（E. lanceolatus♂×E. fuscoguttatus♀）是将鞍带石斑鱼（E. lanceolatus♂）和棕点石斑鱼（E. fuscoguttatus♀）通过人工授精的方式杂交选育而成的品种[1]，是我国东南沿海重要的经济鱼类。随着养殖规模的扩大和养殖环境恶化[2]，石斑鱼养殖过程中常受哈维氏弧菌[3]、彩虹病毒[4]和隐核虫[5]等疾病的威胁，造成大量石斑鱼死亡和巨额经济损失。石斑鱼养殖过程中时常暴发的病虫害已成为目前亟待解决的问题。藻类是天然的饲料添加剂，具有很高的营养价值，可以满足鱼类多种营养需求。藻类中含有大量的活性物质可以有效提高鱼体的免疫活性和抗氧化功能[6-7]。研究表明，在刺参饵料中添加6%的小球藻，刺参的体重、体长、增重率和特定生长率等均显著提高[8]。赵子续等[9]在红白锦鲤饵料中添加3.5%的雨生红球藻，发现红白锦鲤的生长性能和抗氧化能力显著提高，体色增强。目前，关于在饵料中添加微藻对珍珠龙胆石斑鱼的影响还未见报道。本研究在团队前期研究基础上，在珍珠龙胆石斑鱼基础饵料中添加小球藻和雨生红球藻，利用静水养殖法研究其对石斑鱼生长、中肾抗氧化能力和组织结构的影响，以期为小球藻和雨生红球藻作为功能性绿色添加剂在珍珠龙胆石斑鱼饵料中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验鱼试验鱼购自天津立达海水资源开发有限公司。1.1.2试验饵料基础饵料购自三通生物工程（潍坊）有限公司（颗粒直径为3 mm）。小球藻粉购自青岛琅玡台集团股份有限公司，雨生红球藻粉（虾青素含量100 mg/kg）购自云南滇虹药业股份有限公司。基础饵料粉碎，过60目筛，根据前期攻毒试验结果，在基础饵料中分别添加0（DZ组）、10%小球藻粉（Chl组）、10%雨生红球藻粉（Hap组），混匀，以挤压机制成直径2 mm的长条饵料，自然晾干，制成直径约为2 mm的硬颗粒状饵料，放入自封袋内，4 ℃保存。饵料营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.009.T001表1饵料营养水平（风干基础）组别水分粗灰分粗脂肪粗蛋白Chl组11.44±0.2310.77±0.0112.88±0.6330.38±0.05Hap组11.94±0.1611.34±0.3212.81±0.2829.16±0.96DZ组6.76±0.1213.05±0.0212.00±0.2531.35±0.36%1.2试验设计试验开始前珍珠龙胆石斑鱼暂养2 w，每天定时投喂2次，期间投喂基础饵料。暂养结束，选取初重为（9.91±0.33） g的鱼540尾，随机分至9个养殖槽中，分为3组，每组3个重复，每个重复60尾。试验使用养殖槽（100 cm×60 cm×60 cm）静水养殖，使用海水晶配置养殖海水，盐度24‰~28‰。试验期60 d。试验期间水温(25±2) ℃，pH值为（8.0±1.0），溶氧大于5.00 mg/L，氨氮小于0.50 mg/L，亚硝酸盐小于0.10 mg/L。每日8：00、16：00饱食投喂2次，日投喂量为鱼体重的1.5%，投喂1 h以虹吸方式吸出残饵粪便。试验期间每日早晚换水2次，每次换水量约占总体积的1/3~1/2。1.3测定指标及方法1.3.1样品采集正式试验的第15 d和60 d，试验鱼饥饿处理24 h，经丁香酚麻醉，每组随机选取30尾鱼在冰浴条件下解剖，剥离中肾、脾脏和肝脏，4 ℃生理盐水冲洗表面，滤纸吸干表面水分，记录肝脏质量和脾脏质量。称取约1 g干净无血的中肾，剪碎置于离心管中，加入其9倍体积的预冷生理盐水，冰浴匀浆，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，取上清，4 ℃保存；各组中肾标本使用生理盐水冲洗，使用4%多聚甲醛固定，用于后续中肾组织结构的观察。1.3.2生长指标分别在试验开始和试验结束测定各组每尾鱼的体重和体长，计算各组增重率（WGR）、特定生长率（SGR）、肝体比（HIS）、脾体比（SSI）和肥满度（CF）。增重率（WGR）=(Wt-W0)/W0×100%(1)特定生长率（SGR）=(lnWt-lnW0)/t×100%(2)肝体比（HSI）=Wh/Wt×100%(3)脾体比（SSI）=Ws/Wt×100%(4)肥满度（CF）=Wt/(Ls)3×100%(5)式中：W0为鱼体初重（g）；Wt为鱼体末重（g）；Wh为鱼体肝脏重量（g）；Ws为鱼体脾脏重量（g）；Ls为鱼体最终体长（cm）；t为养殖时间（d）。1.3.3抗氧化功能采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定中肾的碱性磷酸酶（AKP）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）活性，具体测定方法参照说明书进行。1.3.4组织学形态观察将固定在4%的多聚甲醛中肾取出，叔丁醇逐级脱水后二甲苯透明，进行组织的浸蜡和石蜡包埋，以切片机连续切片，每片厚度5 µm，进行HE染色，使用中性树胶封片，于扫描显微镜下采集组织结构图像，使用Motic DSAssistant Lite 1.0软件进行组织观察。1.4数据统计与分析采用SPSS 22.0进行单因素方差分析（One way ANOVA），Duncan's进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1小球藻和雨生红球藻对珍珠龙胆石斑鱼生长性能的影响（见表2）由表2可知，15 d各组无死亡现象，存活率均为100%，Chl组与Hap组试验鱼的WGR、SGR、HIS、SSI和CF与DZ组差异均不显著（P0.05），Chl组与Hap组试验鱼的WGR、SGR和CF均高于DZ组（P0.05）。60 d时，Hap组鱼的HSI为4.95%，显著高于DZ组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.009.T002表2小球藻和雨生红球藻对珍珠龙胆石斑鱼幼鱼生长性能的影响时间组别初重/g末重/g初体长/cm末体长/cmWGR/%SGR/(%/d)HSI/%SSI/%CF/%15 dChl组9.91±0.3314.95±1.068.86±0.579.76±0.2350.89±10.692.65±0.464.29±0.570.14±0.011.59±0.07Hap组9.91±0.3314.73±0.548.86±0.579.80±0.2048.60±5.472.61±0.264.03±0.840.18±0.021.57±0.05DZ组9.91±0.3314.56±0.508.86±0.579.81±0.1546.90±4.992.54±0.245.31±0.690.20±0.031.55±0.0660 dChl组9.91±0.3336.75±0.748.86±0.5713.01±0.15270.87±7.452.18±0.033.55±0.24b0.13±0.011.67±0.04Hap组9.91±0.3337.63±1.678.86±0.5712.83±0.42279.74±16.892.21±0.074.95±0.20a0.13±0.021.78±0.05DZ组9.91±0.3339.37±2.108.86±0.5713.64±0.43297.30±21.202.29±0.093.05±0.33b0.14±0.021.58±0.11注：同列数据同一时间肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2小球藻和雨生红球藻对珍珠龙胆石斑鱼中肾抗氧化功能的影响（见表3）由表3可知，15 d和60 d时，Hap组鱼的中肾AKP活性均显著高于DZ组（P0.05）；15 d时，Hap组鱼的中肾AKP活性显著高于其他组（P0.05）。60 d时，Chl组鱼的CAT活性显著低于DZ组（P0.05）。与DZ组相比，15 d和60 d Hap组鱼的中肾CAT活性均显著降低（P0.05）。15 d时，Hap组鱼的中肾CAT活性显著低于Chl组（P0.05）。15 d时，Chl组鱼中肾的GSH-Px活性显著低于Hap组和DZ组（P0.05）。15 d时，Hap组鱼中肾的SOD活性显著高于DZ组（P0.05），60 d时，Hap组鱼中肾的SOD活性为7 269.89 U/mL，是DZ组的 2.1倍。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.009.T003表3小球藻和雨生红球藻对珍珠龙胆石斑鱼幼鱼中肾抗氧化功能的影响时间组别AKP/(金氏单位/g)CAT/(U/mg)SOD/(U/mg)GSH-Px/(U/mg)15 dChl组740.06±12.14b40.42±3.53a5 416.78±457.63ab62.06±0.31bHap组1 126.52±96.40a18.76±1.44b6 539.37±874.26a77.89±3.97aDZ组772.09±21.58b34.45±3.35a3 419.68±240.82b80.36±1.02a60 dChl组926.20±25.16ab33.27±2.16b5 190.33±206.75ab92.84±00.70aHap组1 213.01±158.61a26.75±3.72b7 269.89±1 230.07a98.02±12.88aDZ组721.12±6.43b55.57±2.12a3 420.95±18.42b76.58±1.12a2.3小球藻和雨生红球藻对珍珠龙胆石斑鱼中肾组织形态的影响（见图1）由图1可知，DZ组肾小管上皮细胞出现轻度玻璃样变性，部分近曲小管和远曲小管的上皮细胞细胞核消退；Chl组和Hap组细胞结构完整，各细胞间界限较为清晰，细胞核完整未见消退，无组织病变。图1珍珠龙胆石斑鱼中肾组织学形态（40×）注：PCT为近曲小管；DCT为远曲小管；RCo为肾小体；UT为肾小管；PI为肾间质。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.009.F1a1（a）DZ组15 d和60 d肾组织形态10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.009.F1a2（b）Ch1组15 d和60 d肾组织形态10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.009.F1a3（c）Hap组15 d和60 d肾组织形态3讨论3.1小球藻和雨生红球藻对珍珠龙胆石斑鱼幼鱼生长性能的影响小球藻含有丰富的水产动物生长需要的营养物质，其中均衡的氨基酸和必需脂肪酸以及小球藻中独有的生长因子（CGF）均对水产动物的生长具有作用[10]。Xu等[11]研究发现，在银鲫饵料中添加适量的小球藻粉，银鲫的生长性能显著提高。Bai等[12]发现，给许氏平鲉饲喂含有0.5%小球藻藻粉的饵料，试验鱼的生长指标在同组中最高。张宝龙等[13]研究发现，在饵料中添加3.2%的小球藻显著提高了黄颡鱼的生长性能。雨生红球藻含有丰富的虾青素，通过虾青素可以促进鱼体积累维生素A，进而提高鱼的生长性能[14]。王磊等[15]在饵料中添加9.99 g/kg的雨生红球藻，结果发现，七彩神仙鱼的生长性能显著提高，着色效果显著增强。薛登峰[16]研究表明，在饵料中添加7%的雨生红球藻粉可以显著降低凡纳滨对虾的饵料系数，提高特定增长率，促进凡纳滨对虾的生长。曲木等[17]在虹鳟的研究中也得到了相似结果。本试验中，在珍珠龙胆石斑鱼的饵料中添加小球藻和雨生红球藻均未明显提高鱼的生长性能。许国焕等[18]和Shiau等[19]研究发现，当藻类中活性物质的浓度超过某一水平后，会出现明显抑制鱼类生长的现象，原因可能与鱼体中负反馈作用有关，由于藻类活性多糖的刺激，使机体的代谢水平升高，消耗了过多的能量，鱼类生长便回归正常状态或是被抑制的状态，甚至可能影响鱼体健康。本试验中，小球藻粉对珍珠龙胆石斑鱼无促生长作用，原因是小球藻中的活性成分加速了鱼体的新陈代谢，而鱼体中生长激素的表达仍处于正常水平，使鱼体生长与基础饵料组无明显差异。研究表明，在虹鳟[20]和中华绒螯蟹[21]的饵料中添加雨生红球藻对生长指标的影响均不显著，与本试验Hap组试验结果一致。本试验中珍珠龙斑石斑鱼的增重率和生长率均无显著差异，可能与养殖种类、生长阶段等因素相关。3.2小球藻和雨生红球藻对珍珠龙胆石斑鱼幼鱼中肾抗氧化功能的影响在鱼体的代谢过程中会产生大量的超氧阴离子自由基（·O2-），对鱼的组织细胞造成损伤，藻类中的叶绿素和类胡萝卜素具有较强的抗氧化能力，可以清除自由基，改善机体SOD、CAT、GSH-Px等活性，保护组织细胞免受损伤[22]。蔡荣[23]研究表明，在饵料中添加小球藻醇提取物，花鲈幼鱼的CAT略有提高，在添加量为1 500 mg/kg时显著高于DZ组，GSH-Px活性降低。吴仁福等[24]在饵料中添加雨生红球藻发现，三疣梭子蟹血淋巴中CAT活性显著降低，但总抗氧化能力显著提高。研究表明，藻源虾青素能够显著提高东星斑的GSH-Px活性[25]。本试验中，Chl组和Hap组鱼中肾的GSH-Px活性比DZ组均呈由低到高的趋势，而Chl组CAT活性呈下降趋势，Hap组鱼的中肾CAT活性虽有升高但一直显著低于DZ组。原因可能是随着养殖时间增加使GSH-Px活性增强，催化GSH参与还原过氧化物的反应[26]，使反应底物减少，CAT活性降低。雨生红球藻中丰富的虾青素可以直接参与氧化还原过程，淬灭机体产生的自由基，无须动用机体自身的抗氧化酶系统，可能是Hap组CAT指标较低的原因。研究表明，在饵料中添加小球藻，可以使水产动物SOD活性显著提高[11,13,27]。在饵料中添加雨生红球藻可以显著提高凡纳滨对虾[28]和中华绒螯蟹[29]SOD活性。樊玉文等[30]在黄颡鱼饵料中添加雨生红球藻可以显著降低机体氧化损伤，提升抗氧化能力和免疫指标。本研究中，小球藻和雨生红球藻均可以增强珍珠龙胆石斑鱼中肾SOD活性。磷酸酶不仅参与机体的相关代谢过程，还对机体解毒和免疫方面具有重要作用[31]。研究表明，AKP能够增强机体免疫能力，提升水产动物的生长性能[32]。在饵料中添加小球藻，刺参的AKP活性比对照组提升了13.68%[33]。王军辉等[34]研究表明，藻源虾青素可以提高锦鲤的AKP活性，增强免疫机能。本试验中，各组AKP活性排序为Hap组Chl组DZ组，说明小球藻和雨生红球藻均可提高珍珠龙胆石斑鱼幼鱼的中肾免疫功能。3.3小球藻和虾青素对珍珠龙胆石斑鱼幼鱼中肾组织学形态影响本研究中，DZ组的肾小管上皮细胞出现玻璃样变性和细胞核消退的现象，可能与运输过程中鱼体受到应激有关。运输应激本质上是一种机体氧化应激反应。当机体受到外界环境刺激时，会通过氧化还原反应消除体内产生过多氧自由基，但持续且强烈的应激反应会引发水产动物机体组织损伤，并且这种损伤在短期是不可逆的[35-36]。研究发现，运输应激会造成仔猪肾脏组织细胞损伤，出现玻璃样变性的情况[37]，导致雏鸡肾脏组织抗氧化能力下降，引起氧化反应，损伤肾脏细胞[38]。Peyghan等[39]认为，运输环节鱼体产生的排泄物会导致环境中氨氮浓度升高，从而引起肾脏组织发生病变。刘小玲[40]研究发现，运输过程中的应激会提高鱼体皮质醇水平，抑制免疫能力，进而影响鱼体健康。本试验中，Chl组和Hap组鱼的中肾组织结构相比DZ组细胞界限清晰，细胞结构完整，未见明显组织病变。小球藻中丰富的维生素C可以调节鱼体激素水平增强鱼体抗应激能力；其独有的生长因子是细胞活性成分，可以增强机体免疫力并修复受损细胞[41-42]。雨生红球藻中含有大量的虾青素，其特殊的分子结构可以通过吸引自由基中未配对的电子的方式清除游离的自由基，从而产生抗氧化作用[43]。虾青素的分子结构使其具有较强的抗氧化性。研究表明，虾青素的自由基清除能力可以有效地防止机体组织、细胞、DNA等被氧自由基氧化而造成损伤[44-45]。4结论在饵料中添加10%小球藻和10%雨生红球藻在提高鱼体的抗氧化能力及减轻组织损伤等方面有明显效果，雨生红球藻对珍珠龙胆石斑鱼幼鱼抗氧化能力的增强效果优于小球藻。