近年来，宠物行业高速发展，动物伴侣越来越受到人们的青睐，家庭拥有的宠物总量以几何倍数增长。根据《2020年中国宠物行业白皮书》报告，2020年中国城镇犬猫数量超１亿只，宠物养殖正逐渐向精细化和专业化方向发展[1]。宠物健康和生活质量越来越受到重视。微生态制剂在调节宠物肠道菌群结构、促进宠物健康生长方面发挥重要作用[2-3]。宠物的临床微生态制剂的应用较杂乱，微生态制菌株虽然来源广泛，但核心菌株模糊不清，且大部分菌株均未经过益生功能评价，使其作为宠物肠道菌群调节剂的使用效果良莠不齐，无法满足快速发展的宠物市场的需求[4-6]。本研究从健康犬的粪便中分离、鉴定宠物源乳酸菌，对纯化的乳酸菌菌株进行益生功能评价，筛选具有益生潜力的乳酸菌，为制备宠物用微生态制剂提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1培养基MRS及BHI培养基均购自奥博星生物有限公司。DMEM培养基购自北京绿源伯德生物公司。1.1.2试验菌株大肠杆菌（ATCC33760）、志贺氏菌（ATCC25957）、沙门氏菌（CGMCC 1.1869）和空肠弯曲杆菌（ATCC33291）购自青岛海博生物科技有限公司。1.1.3细胞系Caco-2细胞购自北京绿源伯德生物公司。1.1.4主要试剂革兰氏染色试剂（西亚化学公司）、细菌基因组DNA提取试剂盒（诺唯赞生物公司）、Taqmix（金百特生物公司）、引物27F及1492R由六合华大基因有限公司合成。1.1.5试验动物健康中华田园犬购自北京市房山区规模化狗场。1.2测定指标及方法1.2.1样品采集与处理试验样品为在北京采集的不同年龄、不同品种健康犬的粪便共32份，将各个样品采用无菌生理盐水稀释后，使用无菌纱布过滤，除去将样品中的固体残渣，取滤液使用无菌生理盐水按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6进行倍比稀释，４ ℃冰箱保存。1.2.2菌株分离将前处理的样品稀释菌液于各个梯度中吸取200 μL，涂布于的MRS固体平板（含2% CaCO3），每个样品进行3次重复，平板置于37 ℃培养箱24~48 h。挑选具有明显融钙环且具有乳酸菌典型形态的单菌落，纯化，接种于MRS肉汤培养基中，置于4 ℃冰箱保存。1.2.3形态与染色观察将纯化菌株37 ℃培养24~48 h，蘸取菌液涂片进行革兰氏染色，于显微镜下（1 000×）观察记录菌株的形态特征，参照《常见细菌系统鉴定手册》及《伯杰氏细菌学手册》挑选革兰氏染色呈阳性且形态呈球状或杆状的菌株作为后备菌株。1.2.4乳酸菌16S rDNA鉴定将初筛得到的菌株纯化培养24 h，参照文献[5]方法提取菌株基因组DNA，将所提DNA进行PCR扩增并进行琼脂糖凝胶电泳，确认目的条带后送至六合华大基因科技有限公司测序，结果进行BLAST比对，依据序列的相似度判定菌株的种属信息，筛选出鉴定为乳酸菌的菌种类别。1.2.5菌株抑菌能力使用无菌生理盐水将活化培养24 h的大肠杆菌（ATCC33760）、志贺氏菌（ATCC25957）、沙门氏菌（CGMCC1.1869）和空肠弯曲杆菌（ATCC33291）悬液稀释至浓度为10-5 CFU/mL，使用无菌棉签涂布于BHI固体培养基，菌液干燥后将牛津杯置于平板上。将待测乳酸菌培养24 h，8 000 r/min离心10 min取上清液200 μL，加至指示板上的牛津杯，将平板于4 ℃冰箱静置4~6 h，待上清液完全扩散至琼脂后移入37 ℃培养箱，每菌株设置3个重复，对照孔采用等量MRS液体空白培养基，培养12 h，将平板从37 ℃培养箱中取出，通过无菌镊子将牛津杯取下，使用游标卡尺测量抑菌直径，以抑菌圈直径≥13 mm为标准筛选菌株。1.2.6乳酸菌抗生素敏感性将纯化培养后的乳酸菌菌液浓度调整为108 CFU/mL，使用涡旋混匀器混匀，将菌液涂布于MRS固体培养基，待菌液吸收后放置药敏纸片，37 ℃培养24 h。每组重复3次，测量记录抑菌直径。参照《CLSI 抗菌药物敏感性试验实施标准（2018）》中规定进行判定。1.2.7乳酸菌耐酸耐胆盐能力MRS肉汤培养基的pH值分别使用0.1 moI/L HCl调节至2.0、2.5和3.0；MRS肉汤培养基胆盐质量分数通过牛胆盐将其分别调整为0.05%、0.08%和0.10%，121 ℃灭菌20 min。无菌条件下接种乳酸菌菌株，初始活菌数为1×108 CFU/mL，37 ℃培养箱中恒温培养。于0、2 h取样涂布平板统计活菌数，计算存活率。1.2.8乳酸菌细胞黏附试验在6孔培养板中预先置入无菌盖玻片，接种浓度为2×104 cells/mL的Caco-2细胞，使细胞贴附盖玻片生长，将培养板放置在温度为37 ℃、5% CO2的培养箱中。将乳酸菌接种于培养瓶中，置于37 ℃培养箱培养，使用PBS冲洗，调整培养后乳酸菌悬液浓度，使乳酸菌悬液的浓度为1×108 CFU/mL。待Caco-2细胞长成致密单层后，使用PBS缓冲液漂洗细胞2次，每孔加入不含抗生素的1 mL DMEM培养液和1 mL上述制备好的乳酸菌悬液，摇匀，置于CO2培养箱继续孵育，每株菌重复3孔，培养120 min，使用PBS缓冲液洗涤Caco-2细胞5次，除去未黏附的乳酸菌，加入无水甲醇固定20 min，对Caco-2细胞进行革兰氏染色，显微镜下随机选取20个视野，计算100个Caco-2细胞上黏附的菌株个数，以平均每个Caco-2细胞所黏附的菌株个数表示黏附能力。1.2.9动物试验选用2月龄的幼龄中华田园犬共20只，随机分为2组，每组10只，分别为对照组及乳酸菌治疗组。攻毒：采用志贺氏菌（1010 CFU/mL）以10 mL/kg饲喂4次（8 h/次）。对照组攻毒成功后正常饲喂犬粮，治疗组攻毒成功后除饲喂犬粮还需每日饲喂乳酸菌菌株（1010 CFU/mL），饲喂量为10 mL/kg，连续饲喂7 d，记录每日每组犬只腹泻情况。2结果与分析2.1形态特征从32份样品分离出乳酸菌共30株，在平板上培养24~48 h，可观察到平板上形成直径为0.1~2.5 mm，呈圆形、表面湿润且光滑、边缘表现整齐、中间呈凸起的白色菌落。部分分离菌株的革兰氏染色镜检结果见图1。图1部分分离菌株的革兰氏染色镜检结果（1 000×）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.012.F1a1（a）S1染色结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.012.F1a2（b）S3染色结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.012.F1a3（c）J40染色结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.012.F1a4（d）J48染色结果由图1可知，镜检结果均为蓝紫色细菌，S1和S3菌体呈杆状，且排列成长短不一的链状；J40和J48菌体呈球形或卵圆形，多聚集成链状，也有单个分散排列。2.2乳酸菌鉴定结果菌株BLAST比对结果见表1。由表1可知，菌种主要为粪肠球菌（C47、C25、C19、C63、J24、C92、C52、C66、C48、C51）、屎肠球菌（J26、C83、C81、C01、M3、D）及鼠李糖乳杆菌（S1、S3、N17、H91）等菌种。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.012.T001表1菌株BLAST比对结果菌株分离株乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）J40、J48鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）S1、S3、N17、H91粪肠球菌（Enterococcus faecalis）C47、C25、C19、C63、J24、C92、C52、C66、C48、C51清酒乳杆菌（Lactobacillus sake）S19屎肠球菌（Streptococcus faecium）J26、C83、C81、C01、M3、D罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）J41、J96、J01鸟肠球菌（Enterococcus avium）C72、C62动物乳杆菌（Lactobacillus zoonosus）H3约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）S32本试验从32个样品中共分离了30株乳酸菌，部分样品琼脂糖凝胶电泳图见图2。由图2可知，样品均为1500 bp的片段，符合预期。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.012.F002图2部分样品琼脂糖凝胶电泳图注：M为DL5 000 DNA Marker；1~8分别为J48、J40、S1、S3、C47、C25、C19、C63的扩增产物。2.3乳酸菌抑菌测定结果筛选益生菌株最重要的是分离株抑制致病菌的能力，本试验从32个样品中共分离了30株乳酸菌，其中9株菌对大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌及空肠弯曲杆菌4种致病菌的抑菌效果较好。抑菌试验结果见表2。部分菌株抑菌能力测定效果见图3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.012.T002表2抑菌试验结果菌株抑菌直径大肠杆菌志贺氏菌沙门氏菌空肠弯曲杆菌S115.31±0.1316.33±0.4418.72±0.4320.34±0.52J4016.41±0.2521.12±0.5115.03±0.3724.83±0.29J4815.33±0.4919.22±0.6320.51±0.2921.54±0.45S315.82±0.3619.25±0.4816.10±0.1821.23±0.54C2513.22±0.2913.43±0.5911.82±0.5316.92±0.37C1915.41±0.6713.07±0.3812.02±0.5215.11±0.62C639.81±0.3813.02±0.6313.23±0.3915.44±0.54S1910.54±0.5415.13±0.7115.12±0.4818.32±0.36C4710.33±0.4912.84±0.3813.05±0.5915.67±0.73mm图3部分菌株抑菌能力测定效果注：阴性对照即空白MRS培养基。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.012.F3a1（a）菌种对沙门氏菌抑制效果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.012.F3a2（b）菌种对空肠弯曲杆菌抑制效果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.012.F3a3（c）菌种对大肠杆菌的抑制效果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.012.F3a4（d）菌种对志贺氏菌的抑制效果由表2可知，S1、S3、J40和J48对4株致病菌均有抑制作用，且抑菌直径均≥15 mm；C25、C19、C63及S19对4株致病菌均有抑制作用，且对其中3株致病菌的抑菌直径≥13 mm；C47对4株致病菌均有抑制作用，且对且对其中2株致病菌的抑菌直径≥13 mm。由图3可知，相对沙门氏菌，S1、J40和J48菌株对空肠弯曲杆菌的抑菌效果更为明显。2.4抗生素敏感性测定结果（见表3、图4）将抑菌试验筛选得到的9株分离株进行了对7种常用抗生素的敏感性测定试验。由表3可知，9株分离株对青霉素、氨苄西林及头孢噻吩等3种抗生素普遍高度敏感，其中S1对恩诺沙星亦高度敏感，J40对恩诺沙星中度敏感，S1对环丙沙星中度敏感。菌株均表现抗性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.012.T003表3抗生素敏感性测定结果菌株青霉素氨苄西林头孢噻吩恩诺沙星万古霉素庆大霉素环丙沙星J40SSSIRRRJ48SSSRRRRS1SSSSRRIS3SSSRRRRC25SSSRRRRC19SSSRRRRC63SSSRRRRS19SSSRRRRC47SSSRRRRC25SSSRRRR注：S为高度敏感；I为中度敏感；R为抗性。图4部分菌株抗生素敏感性测定效果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.012.F4a1（a）C63对抗生素的敏感性效果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.012.F4a2（b）S19对抗生素的敏感性效果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.012.F4a3（c）C47对抗生素的敏感性效果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.012.F4a4（d）C25对抗生素的敏感性效果2.54株菌耐酸、耐胆盐能力测定结果（见图5）由图5（a）可知，4株乳酸菌在不同pH值下培养2 h后存活率均大于60%，且随着pH值升高，菌株的存活率升高。因此，4株菌的耐酸能力均较强，在pH值为2时J48的存活率超过了80%。由图5（b）可知，4株乳酸菌在不同胆盐质量分数下培养2 h后存活率均大于50%，且菌株的存活率随着胆盐质量分数值升高而降低，其中S1和S3的耐胆盐能力强于J48和J40，存活率均超过70%。图54株菌耐酸、耐胆盐能力测定结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.012.F5a1（a）4株乳酸菌在不同pH值培养2 h的存活率10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.012.F5a2（b）4株乳酸菌在不同胆盐浓度培养2 h的存活率2.6乳酸菌细胞黏附能力测定结果（见表4、图6）图6乳酸菌对Caco-2细胞的黏附效果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.012.F6a1（a）Caco-2细胞10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.012.F6a2（b）J40的黏附作用10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.012.F6a3（c）J48的黏附作用10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.012.F6a4（d）S3的黏附作用10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.012.F6a5（e）S1的黏附作用由表4可知，4株乳酸菌对Caco-2细胞的黏附细菌个数均大于6，其中J40的黏附能力最强。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.012.T004表44株乳酸菌对Caco-2细胞的黏附数量菌株J40J48S1S3黏附细菌数22.71±3.5120.29±3.1410.29±4.928.71±1.48个2.7动物试验结果综合上述试验结果可知，乳酸片球菌J40为本研究中性能最为优良的菌株。因此，选用此菌株进行动物试验。各处理组攻毒幼犬腹泻率见表5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.012.T005表5各处理组攻毒幼犬腹泻率组别1 d2 d3 d4 d5 d6 d7 d8 d9 d对照组10010010090805030100治疗组100100100805020000%由表5可知，各处理组前3 d的腹泻率没有差异，幼犬腹泻率均为100%；第4 d起，各组腹泻率逐渐降低，其中对照组幼犬在第9 d全部停止腹泻，而J40治疗组幼犬则在第7 d全部停止腹泻。因此，菌株J40可降低攻毒幼犬的腹泻率，缩短幼犬腹泻时间。3讨论3.1乳酸菌的鉴定乳酸菌鉴定的首要因素是确定其表性特征，包括基于细菌群体特征、细菌形态、生理学和生物化学特征、代谢物等的形态学和生理学特征[6]。但传统的细菌检测法高度依赖主观判断，且检测周期过于漫长，工作量负荷过大。近年来，16S rDNA序列分析通过直接从核酸水平鉴定乳酸菌，可对分离株特征进行更准确地鉴定[7-8]。本研究中，通过细菌形态学观察和16S rDNA结合鉴定了30株健康犬肠道内容物中的分离株。经鉴定，健康犬肠道内容物中产乳酸菌主要为乳酸杆菌属和肠球菌属。3.2乳酸菌的抑菌性能研究表明，乳酸菌能够通过抑制肠道致病菌的生长，调节氧化应激，增强肠道免疫力，抑制腹泻等疾病的发生，从而维持肠道微生态系统的平衡[9]。因此，选择具备良好抑菌性能的乳酸菌菌株对微生态制剂的研究具有重要意义[10]。研究表明，肠道感染的主要致病菌是大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌以及空肠弯曲杆菌[11-12]。本试验考察乳酸菌对4种致病菌的抑制能力，其中对4种致病菌抑制能力较强（抑菌圈直径≥15 mm）的共有9株分离菌，其中J40、J48经鉴定为乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici），S1、S3经鉴定为鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus），C47、C25、C19、C63经鉴定为粪肠球菌（Enterococcus faecalis），S19经鉴定为清酒乳杆菌（Lactobacillus sake），J40同时对4种致病菌均有抑制能力（抑菌圈直径≥13 mm）且对大肠杆菌、志贺氏菌及空肠弯曲杆菌抑制能力最强，因此抑菌能力最强的菌株为J40。3.3乳酸菌的抗生素敏感性乳酸菌抗生素敏感性亦是益生菌选择的重要指标[13]。本试验分离的30株乳酸菌中有9株具良好抑菌性能，对其进行抗生素敏感性试验后发现其对庆大霉素及万古霉素均具有抗性，对青霉素、氨苄西林及头孢噻吩3种抗生素均高度敏感，表明9株菌株均不携带上述3种耐药基因，其中S1对恩诺沙星亦高度敏感，J40对恩诺沙星中度敏感，S1对环丙沙星中度敏感。因此9株菌株具有一定的安全性和可控性。3.4乳酸菌的耐酸、耐胆盐性能为在肠道发挥积极的生物学作用，添加自外源的乳酸菌需耐受消化道内胃中的低pH值，才能保证在肠道中存在足够的活菌数以生长繁殖，不同乳酸菌菌株对低pH值条件的耐受能力不同，因此耐酸能力对益生菌株的筛选十分重要[14]。选择益生菌菌株的另一个重要因素是对胆盐的抗性。肠道中高水平的胆汁可极大地破坏细菌，对细胞膜造成裂解进而导致细胞膜破裂和膜蛋白分离。研究发现，一些乳酸菌对胆盐具有一定的抵抗力[15]。因此，益生菌在定植肠道前，除需要耐受低pH值外，还需耐受来自胆汁盐类的杀菌作用。本研究经过前期抑菌试验及抗生素敏感性试验的筛选，从中选择性能较好的J48、J40、S1和S3进行了耐酸耐胆盐能力测定，结果显示，4株菌株于pH值为2、胆盐质量分数为1%条件下培养2 h，菌株存活率仍可达到50%，耐酸、耐胆盐能力较好。3.5乳酸菌的黏附性能能够在肠道细胞表面黏附、定植是益生菌在肠道发挥益生作用的前提条件[16-17]，益生菌通过空间占位、产生抑菌物质等对肠道致病菌产生抑制作用，从而调节肠道菌群平衡，预防和治疗肠道疾病。筛选具有高黏附性乳酸菌菌株的主要方法是体内或体外黏附试验，因体内研究存在较大局限性，细胞水平的体外研究成为评估细菌黏附性能的主要途径。本研究选用Caco-2细胞作为受体细胞，对经上述试验筛选出的性能较好的菌株J48、J40、S1和S3进行了细胞黏附能力的测定，结果显示，4株菌对Caco-2细胞的黏附个数均大于6，表明其黏附性能良好，其中J48和J40的黏附个数均大于20，以J40黏附性能最佳。因此，乳酸片球菌J40为本研究中综合性能最佳的菌株。3.6乳酸菌对幼犬细菌性腹泻的影响犬腹泻是兽医临床上常见的一种症状，且多见于幼年。仔犬腹泻的发病率高达30%，病死率达10%~15%，对养犬生产造成了很大的经济损失[18]。引起犬腹泻的病因很多，其中细菌感染肠道引发的腹泻是最常见的感染类型之一[19-20]。本研究通过细菌性腹泻常见致病菌志贺氏菌对2月龄的幼龄中华田园犬进行攻毒，结果表明，与对照组相比，J40治疗组可有效降低攻毒幼犬的腹泻率，缩短治疗时间。4结论本研究中分离自健康犬肠道内的1株乳酸菌经抑菌试验、抗生素敏感性试验、耐酸耐胆盐试验、细胞黏附试验筛选及动物试验验证，性能表现良好，可应用于开发宠物用益生菌剂。