国家规定饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂（中药类除外）的商品饲料。因此，寻找中草药添加剂替代抗生素成为目前研究的重点[1]。黄酮化合物作为饲料添加剂具有抗氧化、抑菌、提高免疫力和促进蛋白质吸收等生物活性[2]，其安全性和有效性与食品添加剂类似[3]。常采用传统溶剂法、超声法、微波法、酶解法等提取黄酮类化合物[4]。传统的溶剂萃取法有机溶剂消耗量大、污染环境，萃取时间过长会导致黄酮类化合物降解[5]。低共熔溶剂[6]（DES）是由氢键受体和氢键给体混合通过氢键交互影响形成一个新的体系[7]，是一种绿色混合溶剂，具有环保、无毒、可生物降解、生物相容性好、成本低廉、易于合成等特点，已经在食品、生物和环境样品分析中应用[5]，在黄精[8]、金莲花[9]、辣木叶[10]等植物中提取黄酮中也有应用。番石榴叶含有黄酮、萜类、酚酸以及挥发油类成分[11]。研究表明，饲粮中添加番石榴叶可以显著提高斑节对虾的生长性能和免疫功能，从而增强其抗病毒感染的能力，降低死亡率[12]。番石榴叶黄酮具有抑菌[13]、止泻[14]、抗病毒[15]、抗氧化[16]、调节免疫[17]等作用，可用作防腐剂、止泻剂、免疫调节剂等。因此，本研究采用绿色低共熔溶剂提取番石榴叶总黄酮，以期为番石榴叶总黄酮饲料添加剂的开发提供参考。1材料与方法1.1试验设备Agilent 8453型紫外可见分光光度仪（美国安捷伦科技公司）；电子天平ME204102（CD）（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；数控超声波清洗器KQ-500DE型（昆山超声仪器有限公司）；德力欧万能高速粉碎机（永康市洪栩工贸有限公司）；水浴恒温振荡器SHZ-88（金坛市医疗仪器厂）；低速大容量离心机TDL-5-A（上海安亭科学仪器厂）；大龙兴创MS-HPro+磁力搅拌器（北京大龙仪器有限公司）；电子恒温不锈钢水浴锅XMTD-6000（上海宜昌仪器纱筛厂）。1.2试验材料与试剂番石榴叶购自广东揭阳，经河池学院邓晰朝副教授鉴定为桃金娘科（Rhodomyrtus tomentosa）番石榴属（Psidium guajava Linn.）的叶子，60 ℃烘干，粉碎，过60目筛密封。芦丁标准品（RG）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；氯化胆碱、亚硝酸钠、九水合硝酸铝、氢氧化钠、乙二醇、甲醇、1,4-丁二醇、1,3-丁二醇、1,2-丙二醇等，均为分析纯，购自西陇科学股份有限公司。1.3标准曲线的绘制参考文献[18]使用亚硝酸钠-硝酸铝显色法测定总黄酮。取芦丁使用70%乙醇精确配置成0.3 g/L的母液，分别等梯度取0~7 mL母液至8个编号的25 mL容量瓶中，依次加入0.75 mL 5%亚硝酸钠、0.75 mL 10%九水合硝酸铝、10 ml 4%氢氧化钠，70%乙醇定容至刻度，测定510 nm处吸光度值，绘制浓度-吸光度标准曲线，拟合线性方程为：y=11.206 0x-0.003 5，R2=0.999 7。1.4单因素试验1.4.1DES组成对提取率的影响氢键受体氯化胆碱和不同氢键供体按照物质的量的比（1∶20）放置在锥形瓶中。各组DES的物质组成见表1。使用保鲜膜封住瓶口，80 ℃下磁力搅拌器搅拌，直至溶解完全呈澄清透明，室温保存。称取粉碎后的番石榴叶0.5 g于锥形瓶中，加入10 mL不同组成的DES，超声提取，离心，采用亚硝酸钠-硝酸铝显色法测定吸光度值，计算其黄酮类化合物提取率，考察DES组成对提取率的影响。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.016.T001表1各组DES的物质组成种类DES-1DES-2DES-3DES-4DES-5DES-6DES-7名称氯化胆碱/乙二醇氯化胆碱/乳酸氯化胆碱/1,4-丁二醇氯化胆碱/1,3-丁二醇氯化胆碱/1,2-丙二醇氯化胆碱/甲醇氯化胆碱/乙醇1.4.2氯化胆碱-乙二醇物质的量的比对提取率的影响氯化胆碱（choline chloride，ChCl）和乙二醇（ethylene glycol，EG）根据不同物质的量的比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，溶解配制成不同浓度的DES。称取粉碎的番石榴叶0.5 g于锥形瓶中，加入10 mL不同浓度ChCl-EG，超声提取后离心，采用亚硝酸钠-硝酸铝显色法测定吸光度值，计算其黄酮类化合物提取率，考察ChCl-EG物质的量的比对提取率的影响。1.4.3液料比比对提取率的影响称量粉碎番石榴叶0.5 g于锥形瓶中，分别加入不同体积ChCl-EG（物质的量的比1∶25）混合溶液，使液料比分别为5、10、15、20、25 mL/g，超声提取后离心，采用亚硝酸钠-硝酸铝显色法测定吸光度值，计算其黄酮类化合物提取率，考察液料比对提取率的影响。1.4.4超声时间对提取率的影响称量粉碎的番石榴叶0.5 g于锥形瓶中，加入ChCl-EG（物质的量的比1∶25）7.5 mL，超声时间为20、40、60、80、100 min，45 ℃、300 W提取离心，超声提取后离心，采用亚硝酸钠-硝酸铝显色法测定吸光度值，计算其黄酮类化合物提取率，考察时间对提取率的影响。1.5响应面优化设计以番石榴叶总黄酮提取率为响应值，选择ChCl-EG物质的量的比（A）、液料比（B）、时间（C）进行3因素3水平响应面试验。响应面试验因素水平设计见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.016.T002表 2响应面试验因素水平设计水平AB/(mL/g)C/min-11∶10102001∶15154011∶2020601.6稳定性试验1.6.1精密度试验取0.1 mL番石榴提取液按照1.3中所述亚硝酸钠-硝酸铝显色法依次加试剂，待显色完成，每隔10 min测定1次吸光度值，做3组平行，计算相对标准偏差（RSD）。RSD=（吸光度标准偏差/平均吸光度）×100%(1)1.6.2重现性试验取0.1 mL番石榴提取液5份，按1.3中所述亚硝酸钠-硝酸铝显色法依次加试剂，待显色完成，测定吸光度值，计算RSD。1.6.3加样回收试验取1 mL番石榴提取液使用70 %乙醇定容至25 mL容量瓶刻度线，混匀，取1 mL稀释液加2 mL芦丁工作液，按1.3中所述亚硝酸钠-硝酸铝显色法依次加试剂紫外测定，计算加样回收率和RSD。1.7数据统计与分析采用Origin 9软件统计分析试验数据，采用Design-Expert 10.0.7软件中的Box-Behnken法设计响应面优化试验方案，对所得数据进行统计分析，获取回归模型及最佳提取工艺参数结果与分析。2结果与分析2.1单因素试验2.1.1DES组成对黄酮类化合物提取率的影响（见图1）由图1可知，DES组成不同，对番石榴叶黄酮的提取率差别较大，其中以DES-1和DES-2两种DES效果较好，当前试验条件下黄酮提取率达16%左右。因此，后续试验选择提取效果最好的DES-1进行进一步考察。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.016.F001图1DES组成对黄酮类化合物提取率的影响2.1.2ChCl-EG物质的量的比对黄酮类化合物提取率的影响（见图2）由图2可知，黄酮类化合物的提取率随ChCl-EG物质的量的比值增大而逐渐上升，整体呈上升趋势，1∶15出现拐点。因此，基于经济、环保、安全等因素的综合考虑，ChCl-EG物质的量的比为1∶15为最佳提取溶剂物质的量的比。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.016.F002图2ChCl-EG物质的量的比对黄酮类化合物提取率的影响2.1.3液料比对黄酮类化合物提取率的影响（见图3）由图3可知，黄酮类化合物提取率随DES溶剂量的增加而上升，液料比在5~20 mL/g呈稳定上升趋势，25 mL/g比20 mL/g略微有所下降，番石榴叶中的黄酮类化合物是一定的，在实际的生产过程中，液料比和生产效益紧密联系，溶剂量用得越多则相对效益减少，而25 mL/g与20 mL/g提取率仅相差0.4%。因此，为减少成本，选取20 mL/g为最佳提取液料比。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.016.F003图3液料比对黄酮类化合物提取率的影响2.1.4提取时间对黄酮类化合物提取率的影响（见图4）由图4可知，黄酮类化合物提取率在20~60 min时间段逐渐上升，60~80 min逐渐平缓，60 min后随着提取时间的增加，可能溶解出其他的物质成分，导致黄酮类化合物的溶出量受到了抑制，使黄酮类化合物提取率变平缓。在80~100 min内黄酮类化合物提取率出现上升趋势，可能是超声仪使用时间过长导致温度不恒定，温度出现上升波动而对黄酮类化合物提取率有影响。因此，为保证提取过程的有效稳定，选择40 min为最佳提取时间。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.016.F004图4提取时间对黄酮类化合物提取率的影响2.2响应面提取优化试验结果2.2.1响应面优化结果（见表3）根据表3的结果在软件Design-Expert 10.0.7输入数据进行分析，评价ChCl-EG物质的量的比（A）、液料比（B）、时间（C）3个独立过程变量对响应值黄酮类化合物提取率（Y）的影响。对所建立的回归模型进行了拟合，并对建立的回归方程进行了统计显著性评价。得到响应值回归分析拟合的二阶多项式方程为黄酮类化合物提取率Y=21.5-0.14A+0.92B+1.42C-0.27AB+0.07AC-0.15BC-0.91A2-1.56B2-1.37C2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.016.T003表3响应面优化结果试验号AB/(mL/g)C/minY/%11∶20152018.1821∶15202019.2531∶20156019.3741∶15206020.8851∶20204020.6561∶20104017.7971∶10152018.1881∶15154021.8291∶15102015.97101∶15154020.71111∶15154020.93121∶15106018.22131∶15154021.99141∶10104017.95151∶10156020.43161∶15154022.06171∶10204020.532.2.2回归模型方差分析（见表4）由表4可知，该模型具有统计学意义，F值=20.55，P=0.000 30.01模型极显著；失拟项P=0.921 80.05模型失拟项不显著，表明模型可行性。本试验的决定系数R2=0.963 5，调整系数R2adj=0.916 7，说明该模型与实际提取过程具有较高的拟合度，试验误差小，可以用于分析ChCl-EG物质的量的比（A）、液料比（B）、时间（C）因素对黄酮类化合物提取率（%）随因素变化趋势和提取率预测。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.016.T004表4回归模型方差分析项目平方和自由度均方F值P值显著性模型47.31095.26020.5500.0003**A0.15010.1500.5900.4671B6.70016.70026.1800.0014**C16.190116.19063.2800.0001AB0.28010.2801.1000.3295AC0.02010.0200.0770.7899BC0.09610.0960.3800.5593A23.46013.46013.5100.0079**B210.190110.19039.8500.0004**C27.86017.86030.7100.0009**残差1.79070.260失拟项0.19030.0620.1500.9218纯误差1.61040.400总和49.10016注：“**”表示影响极显著（P0.01），“*”表示影响显著（P0.05）。由表4可知，3个因素对黄酮提取率的影响因素排序为：CBA，液料比（B）、时间（C）因素对黄酮类化合物提取率有显著影响，ChCl-EG物质的量的比（A）影响不显著。因素之间存在交互作用，交互作用AB、AC、AB影响不显著（P0.05）。各交互作用的响应面分析图见图5~图7。由图5~图7可知，交互作用AB、AC、BC的等高线均趋于圆形，说明其交互作用不显著，与方差分析结果相符。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.016.F005图5物质的量的比和时间对提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.016.F006图6液料比和物质的量的比对提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.016.F007图7时间和液料比对提取率的影响2.2.3回归模型最佳工艺参数的确定及验证利用软件Design-Expert 10.0.7对试验方案进行优化，预测得到黄酮类化合物提取率最佳提取工艺参数为：ChCl-EG物质的量的比为1∶14.52。液料比17.51 mL/g、时间45.54 min，在此条件下黄酮类化合物提取率可达21.99%。考虑生产实际操作性的问题，为了方便试验将最佳提取工艺参数修正为ChCl-EG物质的量的比为1∶15、液料比17 mL/g、时间45 min，为了验证该模型的预测是否可行，在修正后的参数条件下进行5次平行试验。结果表明，在修正条件下，黄酮类化合物提取率可达21.01%，与模型预测值21.99%值接近，RSD为1.1%，说明该模型可行。2.3稳定性试验经稳定性试验发现，低共熔溶剂法提取番石榴叶总黄酮的试验精密性较好，RSD为1.63%，显色重现性良好，RSD为1.70%，加样回收试验黄酮类化合物回收率值为101.35%，RSD为0.65%，表明该方法稳定可行。3结论使用DES作为提取剂可以从番石榴叶提取黄酮类化合物，提取率的提取范围为15.97%~22.06%，表明DES可以作为提取黄酮类化合物的提取溶剂。通过Design-Expert 10.7 软件优化得出最佳参数，调整参数为：氯化胆碱/乙二醇（DES）物质的量的比1∶15、提取时间45 min、液料比17 mL/g，黄酮类化合物提取率21.01%，RSD为1.1%，与模型预测值相差0.98%，从数据R2和Radj值分析出实际试验过程与推测模型贴近，说明实际操作误差小，可排除自身试验操作带来的误差，表明试验所用工艺具有可行性和合理性，可以为开发番石榴叶资源提供参考。