近年来，具有抗生素耐受性的微生物种类越来越多，在动物饲粮中不合理使用抗生素会导致细菌耐药性传播、畜牧类肉制品质量下降等[1-3]。因此，开发新型的抗菌药物已成为医学、食品、饲料等领域亟待解决的问题。昆虫抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）的研究就是其中一类。凤蝶、家蚕、斜纹夜蛾、黑水虻等昆虫因具有良好的抗菌肽开发价值也被广泛研究[4-6]。黑水虻（Hermetia illucens）是双翅目水虻科扁角水虻属的一种腐食性昆虫，可以有效处理餐厨垃圾和农业废弃物，生产出高价值的动物蛋白饲料[7-8]。黑水虻幼虫具有先天免疫系统，可以产生抗菌物质，抑制细菌、真菌和病毒[9-10]。研究表明，黑水虻幼虫通过进食含有高密度细菌的饲粮，其表达抗菌肽水平显著提升，体液免疫反应增强[11-12]。抗菌肽不易产生耐药性、毒副作用小，对某些耐药菌具有一定的杀灭作用。因此，抗菌肽被认为是理想的抗生素替代物[13-14]。与普通抗生素不同，阳离子抗菌肽不能提高细菌的突变率，作用于细菌细胞膜内外，使其裂解或通过抑制细菌遗传物质和蛋白的合成，从而对细菌造成破坏，达到抑菌的目的[15-18]。因此，黑水虻对新型抗菌肽的开发具有重要意义。本研究旨在提高诱导免疫应答的幼虫抗菌物质的表达，确定最佳诱导条件，研究其抑菌活性，为抗菌肽药物的研究提供参考。1材料与方法1.1试验材料及仪器黑水虻虫卵由学才达养殖合作社提供。沙门氏菌（Salmonella enteriditis CICC21482）；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus 临床分离株）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC25923）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC27853）、大肠杆菌（Escherichia coli ATCC35218）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae ATCC700607）均由武汉工程大学实验室保存。试验试剂：无水甲醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈（ACN）、三氟乙酸（TFA）、苯基硫脲均为分析纯。试验仪器：真空冷冻干燥机、旋转蒸发仪、Sep-PakC18固相萃取柱，紫外分光光度计、自动ELISA检测仪。LB液体培养基、LB固体培养基均参考《分子克隆实验指南》中培养基配方配制。1.2测定指标及方法1.2.1黑水虻的饲养和诱导将黑水虻虫卵置于人工气候箱中使用麦麸孵化，人工气候箱温度为（27±3）℃，湿度（65±8）%。待幼虫称重至3龄期，分8个饲养盒使用混合饲粮（含水量70%）饲养黑水虻幼虫，幼虫生长至5龄期时对其进行诱导，饲养24 h。为了引发幼虫免疫反应产生抗菌肽，添加金黄色葡萄球菌菌液（OD600 nm=2.1）、大肠杆菌菌液（OD600 nm=2.3）、植物油进行诱导。混合饲粮配比为2.5 kg猪粪、1.5 kg餐厨垃圾、150 mL植物油、150 mL菌液、2 kg水。P1为对照组黑水虻仅添加基础饲粮（猪粪、餐厨垃圾）饲养，P2~P8中黑水虻均采用不同的诱导源饲养，每个诱导组有500 g虫子，每只虫子约0.18~0.25 g。1.2.2抗菌粗肽的提取1.2.2.1溶剂法参考文献[19]方法取诱导后的幼虫，冲洗干净，滤纸吸干虫体表面水分，300 mL甲醇∶水∶乙酸（90∶9∶1）中充分匀浆，抽滤后的提取物在旋转蒸发器中减压除去甲醇。通过用氯仿和乙酸乙酯顺序提取，从样品中分离出蛋白质和脂质，收集提取物水溶性部分。每组样品在旋转蒸发器中减压浓缩，所有组分真空冷冻干燥，-20 ℃冰箱保存。1.2.2.2断头取血淋巴法将免疫后的黑水虻幼虫200只剪去头部，将血淋巴收集含有少量苯基硫脲晶体的试管中，12 000 r/min离心10 min去除脂质和细胞碎片。对提取物进行固相萃取：使用等体积0.1%冰冷的三氟乙酸水溶液稀释，上清液注射至Sep-PakC18高吸附固相萃取柱，分别使用20 mL 10%、20%、30%、50%、80%的ACN在酸化水（0.05%TFA）中分步洗脱，收集各组分，分别为P10、P20、P30、P50、P80。以MRSA、KPN、SE作为指示菌，测定每个组的抑菌活性。1.2.3抑菌活性1.2.3.1滤纸片法滴加200 µL培养12 h的测试菌种于LB平板，均匀涂布，将灭菌的药敏纸片均匀贴于培养皿表面，每组设阳性对照组（0.25 g/L硫酸庆大霉素）、诱导组（8组）、阴性对照（提取液），抗菌肽浓度为100 g/L，加样量为20 µL，放入37 ℃培养箱培养24 h，使用游标卡尺测量抑菌圈，每组3个平行，取平均值。1.2.3.2液体培养抑制测定法将MRAS、SE、KPN在LB培养基中培养至适宜浓度（105 CFU/mL），采用微量二倍稀释法，使抗菌肽浓度依次为100.00、50.00、25.00、12.50、6.25 g/L，铺入96孔细胞培养板（50 µL/孔）中，每孔加入10 µL抗菌肽。将96孔培养板放入37 ℃生化培养箱12 h，使用自动ELISA检测仪测定600 nm波长处的光密度值，根据光密度值确定其抑菌活性。一般认为吸光度没有发生明显变化（ΔOD600 nm≤0.05）的抗菌肽浓度即为最小抑制浓度。1.2.3.3细菌生长曲线将100 µL的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌液（OD值约为0.1）接种至25 mL LB培养基中，加入10 µL幼虫抗菌肽粗提物，混合物在37 ℃ 180 r/min的旋转摇床中培养。使用紫外分光光度计测定OD600 nm值，共测定13 h细菌OD值，以OD值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制生长曲线。2结果与分析2.1不同诱导条件下的抗菌肽粗提物的抑菌活性（见表1）由表1可知，不同诱导方法诱导黑水虻后所产生抗菌肽对大肠杆菌（革兰阴性）和金黄色葡萄球菌（革兰阳性）均有抑菌活性，但活性存在差异。P8组（植物油+混合菌液诱导）抗菌肽对以上两种致病菌的抑菌活性最强，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈直径分别为20.20、18.00 mm，但和阳性对照组（庆大霉素浓度为0.5 g/L）相比还有差距，P1未诱导组抑菌圈直径分别为12.25、11.95 mm，可能是饲粮中餐厨垃圾和猪粪中含有一定微生物，可以看作轻微的诱导因素，使幼虫产生了一定的免疫反应。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.015.T001表1不同诱导条件下的抗菌肽粗提物的抑菌活性组别诱导因素抑菌直径/mm大肠杆菌金黄色葡萄球菌植物油大肠杆菌金黄色葡萄球菌阳性对照———22.95±0.1122.80±0.14P1———11.95±0.4612.25±0.21P2+——16.70±0.2117.55±0.30P3—+—16.65±0.1416.45±0.28P4——+15.00±0.3515.70±0.25P5++—18.00±0.3219.00±0.23P6+—+17.25±0.2817.10±0.56P7—++17.50±0.3516.25±0.32P8+++18.10±0.2020.20±0.42注：“—”表示饲粮中未添加诱导源，“+”表示饲粮中添加诱导源。诱导组对微生物的抑制效果总体优于未诱导组。氯仿提取相和乙酸乙酯提取相均无抗菌活性，只有水溶液提取物中含有抑菌活性成分。采用菌液对黑水虻幼虫进行诱导，产生的抗菌肽对病原菌的抑制效果优于植物油诱导组，添加大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合诱导组，产生的抗菌肽抑菌效果优于单一因素诱导组。可能是不同诱导源诱导昆虫所产生的免疫物质存在活性差异，或许可以作为特定的诱导方法产生对特定的细菌产生抑菌效果的抗菌肽。2.2抗菌粗肽对细菌生长的抑制作用（见图1）由图1可知，对照组（细菌正常生长）和P1未诱导组细菌生长趋势大致相同，在经过3~4 h对数期菌体数量会迅速增大，后续增长趋势下降。图1抗菌粗肽对细菌生长的抑制作用10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.015.F1a1（a）抗菌肽对大肠杆菌的抑制作用10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.015.F1a2（b）抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抑制作用诱导组抗菌肽在稳定期后菌体数量均达到稳定，均能够明显抑制金黄色葡萄球菌生长，在13 h内未出现对数增长期，表明黑水虻抗菌肽能够延后细菌进入指数增长期的时间，在此期间能够抑制细菌数量增加。可能是因为抗菌肽对细菌造成破坏，影响了菌体的正常代谢，造成菌体生长缓慢。P8抗菌肽（添加植物油混合菌液诱导）抑制菌体生长效果最好，P1、P4抗菌肽对大肠杆菌生长的抑制效果弱于对金黄色葡萄球菌，说明不同诱导方法产生的抗菌肽对不同微生物的抑菌效果不同。2.3固相萃取后各组分的抑菌活性（见图2、表2）由图2、表2可知，采用滤纸片法测定了血淋巴提取物的抑菌活性，发现其中有抗MRSA活性组分，但是比KPN、SE抑菌活性较低，其中20%乙腈洗脱组分的抑菌活性最为显著，但是与抗生素还有差距。抗菌肽对MRSA、KPN、SE均有抑菌活性，对SE的抑菌活性最强，在10%、20%和50%洗脱组分中均观察到抑菌区域，水溶液洗脱组分并未观察到抑菌区域。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.015.F002图2Sep-Pak C18 柱固相萃取后组分对沙门氏菌的抑菌活性检测10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.015.T002表2不同百分比乙腈洗脱组分的抑菌活性检测结果组别耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）沙门氏菌（SE）肺炎克雷伯菌（KPN）青霉素———四环素15.75±0.2116.25±0.1715.95±0.14P10—7.50±0.24—P206.60±0.2010.00±0.459.75±0.26P30———P50—6.50±0.209.00±0.32P80———溶剂———注：“—”表示没有观察到抑菌效果。2.4不同浓度水溶性提取物对不同微生物生长的抑菌活性（见图3）由图3可知，MRSA、大肠杆菌（E. coli）KPN、铜绿假单胞菌（PAE）的最小抑菌活性（MIC）为25 g/L、SE的最小抑菌浓度为12.5 g/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.015.F003图3不同浓度水溶性提取物对不同微生物生长的抑菌活性水溶性提取物以浓度依赖的生长方式对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌具有广谱抗菌活性，在特定浓度下表现出显著的抑制微生物生长能力。3讨论本研究采用酸性甲醇提取法和直接收集的血淋巴，均可从幼虫中提取出抗菌物质，诱导组对细菌表现出不同程度的抑制作用，抗菌肽有抗MRAS活性成分，不同饲粮结构与细菌诱导使黑水虻抗菌肽对细菌的总体抗菌活性有显著影响，因此黑水虻免疫应答具有“非专一性”的，不同诱导源均可诱导昆虫产生具有抗菌广谱性的多肽，并不是针对某一特定的抗原(诱导)物质[20-21]。本研究中，向饲粮中添加诱导源可以诱导黑水虻免疫，获得抗菌肽，诱导方法以及操作处理上比针刺法简单，适合大规模诱导昆虫。为应对病原微生物的入侵，黑水虻可产生多种不同的抗菌肽。Choi等[22]使用大肠杆菌诱导黑水虻产生的抗菌肽对革兰氏阴性菌具有很强的抑菌活性，具有作为抗菌肽物质开发新型抗菌药物的潜力。Li等[23]使用两种来自黑水虻的防御素样肽抗菌肽DLP2和DLP4首次在毕赤酵母中表达，对革兰氏阳性菌尤其是MRSA具有较强的抑菌活性，在DLP2/DLP4存在的情况下，MRSA的30 d连续传代不能产生抗性突变体，这可以作为特定的诱导方法产生对某种细菌起抑制作用的抗菌肽。在前蛹期前的黑水虻幼虫可以被开发作为一种高质量蛋白质和油以及几丁质、AMPs和黑色素的高含量来源，目前，黑水虻幼虫在水产养殖和畜禽生产广泛应用[24-25]。Yun等[26]对虹鳟鱼饲喂含有植物乳杆菌感染增加黑水虻抗菌肽表达的饲粮，发现虹鳟鱼的生长和免疫学指标均得到了改善，幼虫提取物对鱼的致病菌具有抑制活性，有望成为水产养殖的良好饵料来源。Gobbi等[27]研究表明，在饲粮中使用源自黑水虻的蛋白质可以显著降低动物腹泻的发生率，幼虫抗菌肽可以作为饲料添加剂提高畜禽免疫力，改善动物生长性能，从而促进畜禽生产繁殖。AMPs拥有良好的理化特性，活性较稳定，可以提高饲粮品质，延长保质期。上述研究表明，黑水虻抗菌粗肽是一种具有广谱抗菌性的物质，可能在对抗MRSA、控制感染方面有用。因此，黑水虻抗菌粗肽在医药领域、食品防腐、饲料添加剂等领域具有良好的开发前景。本研究仅对抗菌肽进行了初步的分离纯化，昆虫幼虫通常含有较多的粗蛋白，进一步对该提取物分离纯化和表征有助于开发一种天然肽类抗菌药物和饲料添加剂。深入研究黑水虻抗菌肽免疫诱导特征、抗菌机理等方面可为黑水虻的独特免疫防御机制提供参考，有望在饲料生产中替代抗生素，一定程度上阻断环境中抗性基因的水平转移[28-29]。4结论诱导组均对革兰氏阳性菌（MRAS、PAE、S. aureus）和革兰氏阴性菌（KPN、SE、E.coli）均有抑菌作用，饲粮中添加植物油、大肠杆菌菌液诱导、金黄色葡萄球菌混合菌液诱导产生的抗菌肽显示出最强的抑菌活性，诱导组抗菌肽抑菌效果均优于未诱导组。黑水虻抗菌肽有抗MRAS活性成分，但与抗生素相比还有一定差距。固相萃取结果显示，20%乙腈洗脱组分对革兰氏阳性菌和阴性菌的抑制效果最好。最小抑菌浓度结果显示，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌为25 g/L、沙门氏菌为MIC为12.5 g/L。