植物提取物或植物源性饲料添加剂可以作为抗氧化剂、促消化剂、增味剂、食欲剂，用于某些病理条件的预防和治疗等，在动物生产中的研究较多。博落回（Macleaya cordata）是传统草药，主要分布在中国、北美和欧洲，主要成分生物碱具有抗菌抗炎等功效[1-2]。博落回生物碱可以治疗雏鸡大肠杆菌病，提高雏鸡生长性能[3]，改善蛋鸡及肉鸡生产性能、抗氧化性能和免疫性能，提高肠道菌群多样性，促进肠道有益菌增殖，提升肠道屏障功能[4-8]；改善乌骨鸡蛋品质，增强其抗氧化和免疫活性，调节其激素分泌[9]。博落回提取物作为饵料添加剂可以减少嗜水气单胞菌对泥鳅重要免疫器官的损害，起保护和免疫调节作用[10]；改善太平洋白虾的生长性能、存活率、免疫反应和抗弧菌病能力[11]；减少断奶山羊下肠道的氧化损伤[12]，影响肠道免疫状态[13]；调节哺乳仔猪肠道微生物群落结构、生长性能和肠道形态，改善肠道环境，调节物质运输和代谢[14-15]。研究表明，博落回提取物可提高荷斯坦犊牛生长性能、养分表观消化率，提高免疫机能[16]，改变犊牛代谢状态[17]。目前，博落回中活性成分提取分离方法主要包括高速逆流色谱法[18-20]、内部沸腾法[21-22]、超声提取法[23-25]、层析柱法[26-27]等，但上述方法较复杂，难以大面积生产推广。本试验对博落回提取工艺进行系统研究，旨在简化提取工艺路线，保证产品质量，降低提取成本，提出切实可行的工业化生产方案。1材料与方法1.1试验原料博落回果荚和提取物对照品由山东胜利生物工程有限公司提供。1.2主要试剂甲醇（HPLC，国药集团化学试剂有限公司）、乙醇（AR，天津市大茂化学试剂厂）、乙腈（HPLC，国药集团化学试剂有限公司）、硫酸（AR，南京化学试剂股份有限公司）、氢氧化钠（AR，国药集团化学试剂有限公司）、盐酸（AR，南京化学试剂股份有限公司）、三乙胺（AR，国药集团化学试剂有限公司）。1.3主要仪器液相色谱仪Agilentl200（美国Agilent公司）；FW-100型万能粉碎机（上海楚定分析仪器有限公司）；JJ-1型增力电动搅拌器（江苏金坛市中大仪器厂）；BS-3000A型电子天平（上海友声衡器有限公司）；DZIW型调温电热套（北京市永光明医疗仪器厂）；Heidolph 4000旋转蒸发仪（海道夫公司）；SHB-Ⅲ型循环水真空泵（郑州长盛实验仪器有限公司）；xutemp型低温恒温液浴循环两用槽（杭州雪中炭恒温技术有限公司）。1.4测定指标及方法1.4.1博落回提取工艺粉碎博落回果荚使用20倍博落回粉重量的0.5%硫酸水溶液提取，70 ℃提取1.5 h，过滤，得一浸液；将一浸湿滤渣使用10倍博落回粉重量的0.5%硫酸水溶液提取，70 ℃提取1.5 h，减压过滤，得二浸液；将二浸湿滤渣使用10倍博落回粉重量的0.5%硫酸水溶液提取，70 ℃提取1.5 h，减压过滤，得三浸液；将三浸湿滤渣使用10倍博落回粉重量的0.5%硫酸水溶液溶解，70 ℃提取1.5 h，减压过滤，得四浸液；三浸液与四浸液混合，套用至下批浸提；将一浸液和二浸液混合，使用氢氧化钠调节pH值至9~10，静置析晶24 h，过滤，得湿初提物，鼓风干燥6 h，得博落回初提物。博落回初提物使用5倍重量90%乙醇溶液加热回流提取1 h，减压过滤，得一次提取液；湿提取物使用5倍重量90%乙醇溶液加热回流提取1 h，减压过滤，得二次提取液（套用至下批）；一次提取液使用0.1%（质量体积比）粉末活性炭搅拌脱色1 h，减压过滤，得脱色液，56 ℃、-0.1 MPa减压浓缩，浓缩液降至室温，加0.5%硫酸水溶液调节pH值至2~3；低温析晶1.5 h，过滤得湿晶体，60 ℃、-0.1 MPa干燥2 h，得橙黄色博落回产物。1.4.2博落回含量检测1.4.2.1对照品溶液的制备取血根碱对照品、白屈菜红碱对照品适量，精密称定，分别加甲醇-1.0%盐酸溶液（50∶50）溶解，制成每1 mL含血根碱0.l mg、白屈菜红碱0.05 mg的溶液[28]。1.4.2.2供试品溶液的制备取博落回提取物25 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇-1.0%盐酸溶液（50∶50）80 mL，超声处理30 min，取出，冷却，稀释至刻度，摇匀，过滤，得滤液[28]。1.4.2.3色谱条件十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈为流动相A，0.2%三乙胺溶液（磷酸调节pH值至2.5）为流动相B，进行梯度洗脱。理论板数按血根碱峰计算，应不低于5 000。检测波长为270 nm，流速0.8 mL/min，柱温35 ℃，进样量10 μL[28]。流动相洗脱参数见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.019.T001表1流动相洗脱参数时间/min流动相A/%流动相B/%025751425752760402925753525752结果与分析2.1酸水提取时间据《兽药质量标准汇编》[28]中博落回提取物制法，取博落回果实，加0.5%硫酸溶液70 ℃渗漉提取。本研究取粉碎后博落回果荚，加适量0.5%硫酸溶液70 ℃搅拌提取，分别在0.5、1.0、1.5、2.0 h取样检测浸提液效价。不同浸提时间下酸水中博落回含量见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.019.T002表2不同浸提时间下酸水中博落回含量浸提时间/h血根碱含量/(mg/L)白屈菜红碱含量/(mg/L)0.5260.3696.541.0301.35112.691.5323.24134.582.0307.68120.54由表2可知，随着提取时间延长，浸提液中主要成分含量下降，可能因为加热或氧化导致有效成分降解。最佳浸提时间为1.5 h。2.2酸水提取液料比取粉碎的博落回果荚，加适量0.5%硫酸溶液70 ℃搅拌提取，比较不同液料比对浸提率的影响。不同液料比对浸提率的影响见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.019.T003表3不同液料比对浸提率的影响液料比/(mL/g)浸提率/%一次浸提二次浸提三次浸提四次浸提血根碱白屈菜红碱20———48.3450.092010——73.2671.41201010—86.4481.702010101095.5690.54注：“—”表示未浸提，下表同。考虑产品收率、生产设备承受能力、套用等情况，确定博落回果荚经过4次酸水提。由表3可知，一次浸提液料比为20 mL/g，后三次浸提液料比为10 mL/g。为简化生产操作流程，节约生产成本，减少污水排放，可将三次浸提液与四次浸提液混合，套用至下批博落回一次浸提。本试验对此工艺进行验证，方案可行。2.3初提物浸提时间博落回经酸水提取、结晶获得的初提物含量较低，为获得纯度较高博落回提取物，据《兽药质量标准汇编》[28]中初提物提纯制法，本研究取粉碎后博落回初提物，加适量90%乙醇加热回流提取，分别在0.5、1.0、1.5、2.0 h取样检测浸提液效价。不同浸提时间下乙醇溶液中博落回含量见表4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.019.T004表4不同浸提时间下乙醇溶液中博落回含量浸提时间/h血根碱含量/(mg/L)白屈菜红碱含量/(mg/L)0.52 850.34996.461.03 147.521 168.211.53 062.431 089.562.03 003.651 014.65由表4可知，随着提取时间延长，浸提液中主要成分含量下降，可能因为加热或氧化导致有效成分降解。浸提时间可以选用1 h。2.4初提物浸提液料比取粉碎后博落回初提物，加适量90%乙醇回流提取，比较不同液料比对浸提率的影响。不同液料比对浸提率的影响见表5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.019.T005表5不同液料比对浸提率的影响液料比/(mL/g)浸提率/%一次提取二次提取血根碱白屈菜红碱5—59.1458.145571.5869.70考虑产品收率、生产设备承受能力、套用等情况，确定博落回初提物经过两次乙醇回流提取。由表5可知，一次浸提液料比为5 mL/g，二次浸提液料比为5 mL/g，残渣中剩余有效成分不足5%。为简化生产操作流程，节约生产成本，减少污水排放，可将第二次提取液套用至下批博落回初提物一次浸提，工艺验证可行。2.5活性炭用量为提高博落回提取物纯度，需对一次提取液进行脱色、浓缩、降温结晶。取适量一次提取液转分别使用0.05%、0.10%、0.50%、1.00%（质量体积比）活性炭粉末搅拌脱色1 h，得脱色液，分别取样检测提取液效价，计算收率损失，进一步制备提取物。不同活性炭用量对产品质量的影响见表6。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.019.T006表6不同活性炭用量对产品质量的影响活性炭用量血根碱损失白屈菜红碱损失血根碱含量白屈菜红碱含量0.05-2.53-3.4539.6515.370.10-3.87-4.0147.5621.550.50-11.99-12.5055.6022.661.00-20.57-21.4359.3811.66%由表6可知，活性炭可以吸附提取液中的有效成分，用量与损失率呈正相关，增加用量时制备的提取物纯度显著提高，血根碱含量大于40%，总含量大于60%。综合考虑，选用0.1%活性炭用量。2.6析晶pH值的选择脱色液减压浓缩，需调节pH值至酸性，使博落回提取物结晶。取适量浓缩液，使用硫酸分别调节pH值至1.0、2.0、3.0、4.0、5.0，静置析晶，分别减压过滤，计算产品收率（以浓缩液为标准计算）。不同析晶pH值对产品质量的影响见表7。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.019.T007表7不同析晶pH值对产品质量的影响pH值血根碱浸提率/%白屈菜红碱浸提率/%1.097.0391.232.096.6789.923.095.4687.634.067.5761.065.053.8645.19由表7可知，脱色液酸度越高，析出的博落回提取物越多，产品收率越高，过程为博落回中生物碱与强酸中的氢离子结合形成类似盐类结构的佯盐而析出。综合确定，将pH值调至2~3。2.7析晶时间取适量浓缩液，利用硫酸调节pH值至2.0，低温析晶，分别在0.5、1.0、1.5、2.0 h取样过滤，检测母液中生物碱盐含量。不同析晶时间母液中残留生物碱情况见表8。综合考虑，将析晶时间定为1.5 h。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.019.T008表8不同析晶时间母液中残留生物碱情况析晶时间/h血根碱损失/%白屈菜红碱损失/%0.5-12.13-10.571.0-5.67-4.631.5-3.13-4.192.0-3.07-3.752.8工艺验证结果（见表9）由表9可知，选择博落回提取最优参数进行3批验证试验，提取物中血根碱含量大于40%，总含量大于60%，产品符合兽药质量标准，但工艺收率偏低，今后试验应对该工艺进行改进，旨在提高产品收率。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.019.T009表9工艺验证结果批次血根碱含量白屈菜红碱含量血根碱浸提率白屈菜红碱浸提率142.7318.7031.5334.90249.6620.5640.0842.98348.5320.3438.5636.45%3结论研究通过单因素试验确定了博落回提取的最佳工艺，并进行3批工艺验证试验，证明工艺稳定可行。浸提液套用工艺可以降低生产成本，溶剂可回收利用，对环境污染较小。与超声提取、高速逆流色谱提取、层析柱提取等博落回的分离纯化方法相比，此工艺操作简单易行，只需使用1种溶剂，对设备要求较低，为工业化生产博落回提取物提供参考。