桑叶是蚕的主要食料，可入药，具有疏散风热、清肝明目等功效。桑叶中含有丰富的黄酮、多糖类物质，可以降糖、降脂、抗炎等[1-3]。在动物生产方面，植物多糖也表现出多重生理功能，可以明显改善动物肠道健康[4-6]，增强动物抗氧化能力[7]，提高生长性能，增强免疫力[8-11]，改善禽类动物的产蛋性能[12-13]。提取多糖的常用方法包括超声波法[14-15]、微波法[16-17]、酶法[18-19]等。超声波法提取速率快、提取率高、反应条件温和，但仪器会在提取过程中发出噪声；微波法提取速率快，但提取过程升温快、反应剧烈，会对提取物产生破坏作用；酶法提取法条件温和，对热不稳定性物质保存较好，但酶对环境较为敏感，需严格控制试验条件。减压内部沸腾法[20]可在较低温度下使预先进入植物组织内部的低沸点溶剂产生剧烈沸腾，加速提取过程，提高提取率。本文探索减压内部沸腾法提取桑叶多糖，响应面法[21-22]设计工艺优化方案，以期为开发利用桑叶多糖提供参考。1材料与方法1.1试验材料新鲜桑叶采自四川省内江市东兴区双桥镇元觉村。主要试剂：无水葡萄糖、苯酚、浓硫酸、无水乙醇均为分析纯。主要仪器：HH-601恒温水浴槽（江苏金坛亿通电子公司）、SHZ-95B真空泵（上海互佳仪器设备有限公司）、TGL-10C离心机（上海安亭科学仪器厂）、UV-1800PC-DS2紫外-可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）。1.2试验方法1.2.1桑叶多糖提取新鲜桑叶洗净，室温下晾干，70 ℃烘干24 h至恒重，粉碎，过筛得桑叶粉末。取10.0 g桑叶粉末于烧瓶中，加入30 mL乙醇溶液，室温（25 ℃）浸泡30 min，使桑叶内部的多糖类物质充分解吸，加入热水并将烧瓶置于同温度的水浴锅，安装装置使体系压力下降至285 mmHg。乙醇在桑叶组织内部沸腾，提取，取出冷却，4 500 r/min离心10 min，取上清液，使用去离子水定容，得桑叶多糖待测液。1.2.2多糖提取率计算按苯酚-硫酸法[23-24]测定，绘制标准曲线并得到方程y＝0.011 12x+0.001 8，R2=0.998 5。取1 mL待测液按苯酚-硫酸法显色测定，通过标准曲线换算桑叶多糖含量。多糖提取率=多糖测得量/桑叶粉末质量×100%(1)1.2.3试验设计1.2.3.1单因素试验固定液料比20 mL/g、提取温度80 ℃、提取时间20 min，测定乙醇体积分数为30%、40%、50%、60%、70%时桑叶多糖提取率。固定乙醇体积分数40%、提取温度80 ℃、提取时间20 min，测定液料比为10、15、20、25、30 mL/g时桑叶多糖提取率。固定乙醇体积分数40%、液料比20 mL/g、提取时间20 min，测定提取温度取50、60、70、80、90 ℃时桑叶多糖提取率。固定乙醇体积分数40%、液料比20 mL/g、提取温度80 ℃，测定提取时间取10、15、20、25、30 min时桑叶多糖提取率。1.2.3.2响应面试验根据单因素试验结果，选取合适的因素水平，采用Design-Expert 8.05优化提取工艺。因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.017.T001表1因素水平设计水平A乙醇体积分数/%B液料比/(mL/g)C提取温度/℃D提取时间/min-1301070150402080201503090252结果与分析2.1工艺条件对桑叶多糖提取率的影响2.1.1乙醇体积分数对桑叶多糖提取率的影响（见图1）由图1可知，乙醇体积分数为40%时，桑叶多糖提取率最大。乙醇体积分数太小时，在相应的压强和温度下沸腾不剧烈，提取率较低；桑叶多糖具有一定的水溶性，乙醇体积分数过大导致多糖溶解性差而影响提取率。因此，提取桑叶多糖的乙醇体积分数约40%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.017.F001图1乙醇体积分数对桑叶多糖提取率的影响2.1.2液料比对桑叶多糖提取率的影响（见图2）由图2可知，液料比太小时，溶出的多糖较少，桑叶多糖提取率低；液料比太大时，其他水溶性物质溶出对桑叶多糖提取率具有一定影响，过多溶剂影响物料对能量的吸收，导致桑叶多糖的实际提取率略有下降。因此，提取桑叶多糖的液料比约20 mL/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.017.F002图2液料比对桑叶多糖提取率的影响2.1.3提取温度对桑叶多糖提取率的影响（见图3）由图3可知，提取温度过低，分子运动速率较慢，物料内部的乙醇无法剧烈沸腾，不利于提取桑叶多糖；提取温度过高，部分桑叶多糖被破坏，过高温度会造成能量浪费。因此，提取桑叶多糖的温度约70 ℃。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.017.F003图3提取温度对桑叶多糖提取率的影响2.1.4提取时间对桑叶多糖提取率的影响（见图4）由图4可知，桑叶多糖由植物组织内部扩散到溶剂中需要一定时间，多糖在植物组织内外浓度相等时扩散达到平衡，继续延长提取时间也不会使提取率出现明显变化，长时间的提取会造成时间和能量的浪费。因此，提取桑叶多糖的提取时间约20 min。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.017.F004图4提取时间对桑叶多糖提取率的影响2.2响应面优化试验的结果与分析运用Design-Expert 8.05设计试验方案，设置29组试验。试验方案及结果见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.017.T002表2试验方案及结果序号ABCDY/%100-114.592010-14.193-10014.964-1-1003.65500004.576001-13.76701-104.458100-13.58910103.64100-1102.901100-1-14.04121-1002.721301104.1714-11004.911500114.31160-10-12.92170-1-103.1818-100-14.501901014.742000004.562100004.582210-103.7623-10-104.84240-1013.472510014.1326-10104.412711003.992800004.572900004.59由表2可知，将各影响因素的水平编码值作为自变量，桑叶多糖提取率作为因变量，建立二次多项式回归模型：多糖提取率Y=4.57-0.45A+0.63B-0.14C+0.27D+2.5×10-3×AB+0.077AC+0.022AD+1.0×10-4×BC+1.0×10-4×BD+1.0×10-4×CD-0.14×A2-0.62×B2-0.27×C2-0.13×D2。模型相关系数（R）高达0.966，P0.000 1，模型显著，失拟项不显著。为确定各变量对桑叶多糖提取率的影响进行方差分析。变量极差分析结果见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.017.T003表3变量极差分析结果项目平方和自由度均方F值P值显著性模型11.060140.7902 511.490.000 1**A2.48012.4807 869.700.000 1**B4.83014.83015 343.860.000 1**C0.23010.230738.920.000 1**D0.86010.8602 730.080.000 1**AB2.500×10-512.500×10-50.080.782 1AC0.02010.02476.390.000 1**AD2.025×10-312.025×10-36.440.023 7BC01001.000 0BD01001.000 0CD01001.000 0A20.13010.130420.740.000 1**B22.48012.4807 872.250.000 1**C20.48010.4801 535.150.000 1**D20.11010.110350.320.000 1**残差4.403×10-3143.145×10-4失拟3.883×10-3103.883×10-42.990.151 5纯误差5.200×10-441.300×10-4总和11.06028由表3可知，一次项均显著，二次项A2、B2、C2、D2显著，二次项AC显著，其余各项不显著，表明提取条件与多糖提取率间并非简单线性关系。根据F值可以确定，单因素对多糖提取率影响程度为BADC。各因素的响应面交互作用的等高线和响应面图见图5~图10。由图5~图10可知，响应面在各纵坐标上斜率均较大，较陡峭，桑叶多糖提取率对各考察因素均较敏感，各因素对其影响均较显著。等高线可反映考察的两因素间交互作用对桑叶多糖提取率的影响程度。图5、图7~图10等高线具有明显的共圆心的趋势，表明图中两因素交互作用对桑叶多糖提取率的影响程度小；图6等高线形状最特殊，各线条相互偏离，共圆心趋势小，表明乙醇体积分数和提取温度的交互作用强。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.017.F005图5乙醇体积分数与液料比对桑叶多糖提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.017.F006图6乙醇体积分数与提取温度对桑叶多糖提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.017.F007图7乙醇体积分数与提取时间对桑叶多糖提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.017.F008图8液料比与提取温度对桑叶多糖提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.017.F009图9液料比与提取时间对桑叶多糖提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.017.F010图10提取温度与提取时间对桑叶多糖提取率的影响通过模型在设定的条件内求最大值，当乙醇体积分数33.27%、液料比24.17 mL/g、提取温度73.27 ℃、提取时间21.34 min时，桑叶多糖提取率理论预测值可达5.03%。为确认上述工艺条件的可靠性进行验证，适当修正提取条件，在乙醇体积分数33%、液料比24 mL/g、提取温度取73 ℃、提取时间取22 min条件下，重复试验3次，多糖提取率分别为4.97%、4.89%、4.85%，平均值为4.90%，与理论预测值5.03%较为接近，提取工艺正确可行。3结论本研究通过减压内部沸腾法提取桑叶中的多糖类物质，该法易操作，仅需常规仪器设备，对环境友好，易于推广。运用单因素试验和响应面试验优化提取工艺，体系压力下降至285 mmHg，当乙醇体积分数33%、液料比24 mL/g、提取温度73 ℃、提取时间22 min时，桑叶多糖提取率达4.90%。该工艺稳定可行。