五倍子（gallnut chinensis，GC）是我国特有的林特产品，主要由五倍子虫瘿寄生在漆树科植物盐肤木、青麸杨或红麸杨叶上生成[1]。单宁酸（tannic acid，TA）是五倍子的主要药效成分，含量占比为50%~70%[2]。TA具有抗氧化[3]、抑菌[4]、止泻[5]、抗病毒[6]和抗癌[7]等多种生物活性，作为饲料添加剂可以有效缓解腹泻，不会影响动物生长性能[8-9]。TA可以与蛋白质、纤维素和矿物质结合，具有抗营养作用，可以抑制瘤胃发酵过程中功能性微生物的生长活性[10]。短链脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）包括乙酸、丙酸和丁酸，可以通过副交感神经间接调节能量代谢，抑制炎症因子和肿瘤细胞生长，参与调节性T细胞（Tregs）的发育和巨噬细胞的活性[11-13]。支链脂肪酸（branched chain fatty acids，BCFAs）包括异丁酸、异戊酸和戊酸，在大肠中浓度较低[14]，具有抗炎[15]、抗癌[16-17]等作用。畜禽肠道内支链脂肪酸含量异常升高，表明未消化蛋白质在动物后肠异常发酵，伴随氨、苯酚、对甲酚和生物胺分子产生，会对肠道环境细胞造成损伤[18-19]。生物胺（biogenic amine，BA）是生物体内产生的低分子含氮有机化合物[20]，适量BA对维持人体新陈代谢和免疫活性具有积极作用，肠道内BA主要由厌氧微生物发酵产生[21]。BA含量异常升高会对机体产生毒性，导致头疼、消化障碍、高血压、呕吐和腹泻等疾病[22-23]。五倍子TA在犬上的研究较少，本试验研究TA的体外抗氧化特性与其对比格犬粪便体外发酵特性的影响，以期为五倍子TA的深入开发提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1材料与试剂粪便采自华南农业大学试验动物中心5只健康的比格犬。五倍子TA（纯度≥93%）、没食子酸（GA，纯度≥99%），购自五峰赤诚生物科技有限公司。维生素C标准品（vitamin C，VC）、DPPH标准品、黏蛋白购自上海源叶生物科技有限公司；硫酸亚铁购自福晨（天津）化学试剂有限公司；水杨酸、NaHCO3、吐温80购自天津市科密欧化学试剂有限公司；过氧化氢、三氯化铁、K2HPO4购自广州化学试剂厂；PBS溶液购自赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司；铁氰化钾、无水乙醇购自上海凌峰化学试剂有限公司；三氯乙酸购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；总抗氧化能力（T-AOC）测试盒购自南京建成生物工程研究所；KH2PO4购自广东光华科技股份有限公司；酵母膏购自国药集团化学试剂有限公司；蛋白胨购自北京奥博星生物科技有限公司；可溶性淀粉购自福晨（天津）化学试剂有限公司；半胱氨酸购自上海伯奥生物科技有限公司。1.1.2仪器与设备高效液相色谱质谱联用仪（GCMS-QP2020）、高效气相色谱质谱联用仪（UltiMate 3000）、酶标仪（VarioskanTM LUX）、超纯水系统（Flex3）、pH计（STARTER 3100）、恒温汽浴摇床（SHA-82A）。1.2试验设计1.2.1五倍子成分提取及检测五倍子前处理参考郝燕娟等[24]的方法。五倍子烘干，粉碎，过40目筛，取6份0.1 g样品分别加至6个50 mL锥形瓶中，加10 mL甲醇水（1∶1），摇匀，常温放置24 h，超声1 h，使用高速滤纸过滤，过0.22 µm孔径滤膜，移至进样瓶。使用高效液相色谱质谱联用仪，上机检测有效成分。1.2.2体外培养参照Menke等[25]的人工瘤胃装置，进行短期体外粪便发酵培养。发酵底物为1.00 g基础日粮（配料为玉米、甘薯粉、小麦面粉、玉米蛋白粉、大豆粉、甜菜浆、鸡肉粉、鸭肉粉、鱼粉、肉骨粉、磷酸氢钙、维生素和矿物质预混料、混合油和脂肪、液体增味剂和固体增味剂）。结肠培养基含有K2HPO4 3.5 g/L、KH2PO4 10.9 g/L、NaHCO3 2 g/L、酵母膏2 g/L、蛋白胨2 g/L、淀粉2 g/L、黏蛋白1 g/L、半胱氨酸0.5 g/L、吐温80 2 mL/L。TA加入装有56 mL结肠培养基的广口瓶，配成不同浓度的TA结肠培养基。将粪便样品以1∶5（g/mL）的比例与厌氧磷酸盐缓冲液（PBS）混匀。500×g离心2 min，去除大颗粒，将7 mL培养液（悬液）添加至装有培养基的广口瓶中，N2冲洗获得厌氧条件，塞紧瓶塞。39 ℃、90 r/min摇床孵育72 h。本试验分为CON、LTA、MTA和HTA 4组，浓度分别为0、0.125、0.250、0.500 g/L TA，每个组6个重复（前5个重复用于样品分析，最后一个重复用于取样后样品的补充），分别于0、6、12、24、48、72 h取样分析。1.3指标测定及方法将VC、GA、TA待测样品溶于超纯水配成不同待测浓度（0.10、0.50、1.00 g/L）的样品溶液。1.3.1DPPH·清除能力取100 µL样品溶液与100 µL DPPH乙醇溶液（0.1 mmol/L）于96孔板中混匀，25 ℃避光静置30 min，于517 nm处检测吸光度值；取100 µL超纯水与100 µL DPPH乙醇溶液（0.1 mmol/L）于96孔板中混匀，25 ℃避光静置30 min，于517 nm处检测吸光度值；取100 µL样品溶液与超纯水于96孔板中混匀，25 ℃避光静置30 min，于517 nm处检测吸光值。计算DPPH·清除率。DPPH·清除率=1-At-AbAC×100% (1)式中：At为样品和DPPH混合溶液的吸光度；Ac为蒸馏水和DPPH混合溶液的吸光度；Ab为样品和蒸馏水混合液的吸光度。1.3.2OH·清除能力取50 µL样品溶液于96孔板中，依次加入25 µL FeSO4溶液（9 mmol/L）、50 µL水杨酸乙醇溶液（9 mmol/L）、50 µL H2O2溶液（4.4 mmol/L）与100 µL超纯水，混匀，37 ℃静置60 min，于510 nm处检测吸光度值；取50 µL超纯水于96孔板中，依次加入25 µL FeSO4溶液（9 mmol/L）、50 µL水杨酸乙醇溶液（9 mmol/L）、50 µL H2O2溶液（4.4 mmol/L）与100 µL超纯水，混匀，37 ℃静置60 min，于510 nm 处检测吸光度值；取61.11 µL样品溶液于96孔板中，依次加入30.5 µL FeSO4溶液（9 mmol/L）、61.11 µL H2O2溶液（4.4 mmol/L）与122.22 µL超纯水，混匀，37 ℃静置60 min，于510 nm处检测吸光值。计算OH·清除率。OH·清除率=1-At-AbAC×100% (2)式中：At为样品在510 nm处的吸光度；Ac为去离子水在510 nm处的吸光度；Ab为空白组在510 nm处的吸光度。1.3.3·O2-清除能力取20 ℃水浴预热20 min的0.05 mol/L Tris-HCI缓冲溶液112.5 µL于96孔板，依次加入25 µL样品溶液和10 µL 25mmol/L邻苯三酚溶液，混匀，25 ℃水浴反应5 min，加入25 µL 8mol/L HCl终止反应，于420 nm处检测吸光值。空白组使用相同体积的超纯水代替样品溶液重复上述步骤。·O2-清除率=1-ΔAtΔAC×100%式中：At为样品在420 nm处的吸光度；Ac为超纯水在420 nm处的吸光度。1.3.4还原力取2 mL样品溶液、2 mL PBS溶液（pH值7.4）与2 mL 1%铁氰化钾溶液，均匀混合，50 ℃水浴静置20 min，加入1 mL 10%三氯乙酸，25 ℃、3 500 r/min离心10 min。取100 µL上述上清液于96孔板中，依次加入20 µL 0.1%三氯化铁和100 µL超纯水，混匀，静置10 min，于700 nm处检测吸光值。1.3.5总抗氧化能力参照总抗氧化能力检测试剂盒（T-AOC法）的方法测定总抗氧化能力。1.3.6体外发酵试验样品的收集及测定各个时间点采用pH计测定发酵液的pH值，取1 mL样品于2 mL离心管，-80 ℃冰箱保存，补充1 mL相同TA浓度的发酵液进广口瓶。使用气相色谱-质谱联用仪测定乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸、戊酸含量，色谱柱为DB-FFAP毛细管柱。使用液相色谱-质谱联用仪测定乳酸、酪胺、尸胺、色胺、腐胺、组胺、亚精胺、三甲胺、氧化三甲胺含量，色谱柱为C18柱。1.4数据统计与分析数据采用Excel 2019软件进行预数理，SPSS 26.0进行独立样本t检验统计分析。结果以平均值和标准误表示，“***”表示P0.001，“**”表示P0.01，“*”表示P0.05。2结果与分析2.1五倍子甲醇提取液成分分析（见表1、图1）由表1可知，五倍子利用甲醇提取后主要含有没食子酸甲酯、没食子酸、β-五-O-没食子酰-葡萄糖、2-羟基-6-十五烷基苯甲酸和1,2,3,6-四-O-没食子酰-β-D-葡萄糖5种物质。β-五-O-没食子酰-葡萄糖和1,2,3,6-四-O-没食子酰-β-D-葡萄糖是单宁酸的主要结构物质。提取液中没食子酸甲酯含量最高的原因为没食子酸与甲醇反应，五倍子单宁酸为水解单宁酸，会水解成没食子酸和葡萄糖，本试验选择单宁酸的原因为单宁酸属于饲料添加剂，可在比格犬日粮中添加。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.011.T001表1五倍子甲醇提取液主要成分项目分子式保留时间/min归一化占比/%没食子酸甲酯C8H8O55.21140.30没食子酸C7H6O52.30019.26β-五-O-没食子酰-葡萄糖C41H32O266.3907.212-羟基-6-十五烷基苯甲酸C22H36O317.1133.021,2,3,6-四-O-没食子酰-β-D-葡萄糖C34Hd28O226.4132.31图1β-五-O-没食子酰-葡萄糖和1，2，3，6-四-O-没食子酰-β-D-葡萄糖的结构式10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.011.F1a1（a）β-五-O-没食子酰-葡萄糖10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.011.F1a2（b）1，2，3，6-四-O-没食子酰-β-D-葡萄糖2.2GA、TA及VC对自由基的清除能力（见图2）由图2可知，GA和TA与VC类似，对3种自由基具有一定的清除能力，具有一定的还原力和总抗氧化能力。图2VC及GA和TA体外清除自由基的能力注：“***”表示P0.001，“**”表示P0.01，“*”表示P0.05。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.011.F2a1（a）VC、GA、TA清除DPPH·的能力10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.011.F2a2（b）VC、GA、TA清除OH·的能力10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.011.F2a3（c）VC、GA、TA清除·O2-的能力10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.011.F2a4（d）VC、GA、TA还原力10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.011.F2a50.10~1.00 g/L的质量浓度范围内，GA和TA对DPPH·的清除能力均随质量浓度的升高而升高，但均低于VC。0.10 g/L和0.50 g/L GA对DPPH·的清除能力显著低于VC（P0.05），3个浓度的TA与VC对DPPH·的清除能力无显著差异。GA和TA与VC类似，在0.1~1.0 g/L的质量浓度范围内，随着浓度升高，对OH·的清除能力与质量浓度呈正相关，但均低于VC。0.10 g/L质量浓度的GA对OH·的清除能力明显高于TA，0.50 g/L TA对OH·的清除能力明显高于GA，均明显低于VC。0.1~1.0 g/L质量浓度范围内，VC对·O2-清除能力随质量浓度的升高而升高，GA对·O2-清除能力随质量浓度升高而降低，TA未呈规律变化。浓度为0.10 g/L时，GA对·O2-清除能力明显高于VC，0.5和1.0 g/L质量浓度时，GA和TA均明显低于VC。GA和TA的还原力在0.10 g/L质量浓度时均明显高于VC，1.00 g/L质量浓度时明显低于VC。TA的还原力在0.10 g/L质量浓度时明显小于GA，0.5和1.0 g/L质量浓度时明显小于GA。0.10 g/L质量浓度时，GA和TA的总抗氧化能力均明显高于VC，0.50和1.00 g/L质量浓度时均明显小于GA，在0.50 g/L质量浓度，TA的总抗氧化能力明显高于GA。2.3不同浓度TA对比格犬粪便体外发酵不同时间点的pH值和有机酸含量影响（见图3）由图3可知，pH值随着发酵时间的延长而降低，SCFA和BCFA上升，且在0到6 h时间点变化最快。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.011.F003图3不同浓度TA对比格犬粪便体外发酵不同时间点的pH值和有机酸含量的影响由图3（a）可知，在0、24 h，3个TA组pH值均明显低于对照组；在6、12 h，3个TA组与对照组差异不显著；在48、72 h，LTA和MTA组明显低于对照组，HTA组与对照组差异不显著。由图3（b）可知，在0 h，LTA组SCFA含量与对照组无显著差异，MTA和HTA组明显低于对照组；在6、24 h，MTA和HTA组明显高于对照组；在12、48和72 h，3个TA组与对照组差异不显著。由图3（c）可知，在0 h，LTA组BCFA含量与对照组无显著差异，MTA和HTA组明显低于对照组；在6 h，LTA组与对照组差异不显著，MTA和HTA组明显高于对照组；在24 h，LTA和MTA组与对照组差异不显著，HTA组明显高于对照组；在12、48和72 h，3个TA组与对照组差异不显著。由图3（d）可知，在0 h，MTA和HTA组明显低于对照组；在6 h，LTA组与对照组无显著差异，MTA和HTA组明显高于对照组；在24 h，LTA和MTA组明显高于对照组，HTA组与对照组差异不显著；在12、48和72 h，3个TA组与对照组差异不显著。由图3（e）可知，在0 h，LTA组丙酸含量与对照组无显著差异，MTA组和HTA组明显低于对照组；在6 h，LTA和HTA组与对照组差异不显著，MTA组明显高于对照组；在24 h，LTA和HTA组明显高于对照组，MTA组与对照组差异不显著；在12、48和72 h，3个TA组与对照组差异不显著。由图3（f）可知，在0 h，LTA组丁酸含量与对照组差异不显著，MTA组和HTA组显著低于对照组；在6 h，LTA组与对照组差异不显著，MTA组和HTA组明显高于对照组；在24 h，LTA组和MTA组与对照组差异不显著，HTA组明显高于对照组；在12、48和72 h，3个TA组与对照组无显著差异。由图3（g）可知，在0 h，LTA组和MTA组异丁酸含量与对照组相比差异不显著，HTA组明显低于对照组；在72 h，LTA组与对照组相比差异不显著，MTA组和HTA组明显低于对照组。由图3（h）可知，在0 h，LTA组戊酸含量与对照组差异不显著，MTA组和HTA组明显低于对照组；在6 h，LTA组与对照组差异不显著，MTA组和HTA组明显高于对照组；在24 h，3个TA组明显高于对照组；在72 h，LTA组和MTA组与对照组差异不显著，HTA组明显高于对照组。由图3（i）可知，在0 h，LTA组异戊酸含量与对照组相比差异不显著，MTA组和HTA组明显低于对照组；在6 h，LTA组对照组相比差异不显著，MTA组和HTA组明显高于对照组；在24 h，LTA组和MTA组与对照组相比差异不显著，HTA组明显高于对照组。2.4添加不同浓度TA对比格犬粪便体外发酵不同时间点的乳酸和生物胺含量的影响（见图4）由图4（a）可知，在24 h，LTA组乳酸含量明显低于对照组，MTAu和HTA组与对照组相比差异不显著。其余各时间点，3个TA组与对照组相比差异不显著。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.011.F004图4添加不同浓度TA对比格犬粪便体外发酵不同时间点的乳酸和生物胺含量的影响由图4（b）可知，在0 h，LTA组酪胺含量与对照组相比差异不显著，MTA组和HTA组明显低于对照组；在6 h，LTA和MTA组与对照组相比差异不显著，HTA组明显高于对照组；其余各时间点，3个TA组与对照组相比差异不显著。由图4（c）可知，在6 h，LTA组和MTA组尸胺含量与对照组相比差异不显著，HTA组明显低于对照组；其余各时间点，3个TA组与对照组相比差异不显著。由图4（d）可知，在6 h，LTA组和MTA组色胺含量与对照组相比差异不显著，HTA组明显低于对照组；在12和72 h，LTA组和MTA组与对照组相比差异不显著，HTA组明显高于对照组；在0、24和48 h，3个TA组与对照组相比差异不显著。由图4（e）可知，在6 h，LTA组和MTA组腐胺含量与对照组相比差异不显著，HTA组明显低于对照组；在72 h，LTA组和MTA组与相比差异不显著，HTA组明显高于对照组；其余各时间点，3个TA组与对照组相比差异不显著。由图4（f）可知，在0、12和48 h，LTA组和MTA组胺含量与对照组相比差异不显著，HTA组明显高于对照组；在6 h，LTA组与对照组相比差异不显著，MTA组和HTA组明显高于对照组；在24和72 h，3个TA组与对照组相比差异不显著。由图4（g）可知，在0 h，LTA组亚精胺含量与对照组相比差异不显著，MTA组和HTA组明显低于对照组；在6 h，LTA组和MTA组与对照组相比差异不显著，HTA组明显低于对照组；在12和24 h，3个TA组均显著低于对照组；在48和72 h，3个TA组与对照组相比差异不显著。3讨论TA具有良好的生物活性、来源广泛，除了五倍子，自然界多数植物中均能够提取TA，如柿叶、蓝靛果等[26-27]。本研究提取五倍子有效成分进行检测，确定五倍子中的TA结构主要有两种，均为水解单宁，对五倍子TA对DPPH·、OH·和·O2-的清除能力、还原力和总抗氧化能力进行测定，与阳性对照组VC标准品和GA抗氧化活性进行对比，进一步确认了五倍子TA的体外抗氧化能力。林文锐等[28]研究发现，纯化的α-单宁酸浓度小于2 g/L时，单宁酸的总抗氧化能力小于VC，浓度为0~0.5 g/L时，纯化的α-单宁酸对DPPH·的清除能力均大于VC。本研究中，0.10 g/L五倍子TA的浓度显著大于VC，0.50和1.00 g/L五倍子TA的浓度低于VC，3个浓度的五倍子TA对DPPH·的清除能力均小于VC，表明五倍子TA具有较好的抗氧化特性。GA与TA的抗氧化能力基本无显著差异，GA作为TA抗氧化的功能基团，TA和GA的抗氧化能力源自其化学结构中的多个邻苯三酚结构，邻位酚羟基易被氧化，是良好的供氢体[29]。VC的抗氧化能力与其结构中的醇羟基有关，是氧化物的供氢体。同质量浓度的单宁和VC的抗氧化能力可能与羟基的还原性和数目有关[30]。pH值是反映结肠体外发酵品质的重要指标。pH值降低可能对肠道产生有益影响，避免产生腐败的化合物，腐败化合物对肠道健康有害，在犬的粪便中引起难闻的气味（由于氨、苯酚和吲哚的存在）[31]。本试验中，pH值在0~6 h下降幅度最大，随着时间的延长，添加TA组明显低于对照组；原因是TA促进结肠微生物发酵，使SCFAs和BCFAs产量上升，且同一时间点含量高于对照组，从而造成pH值下降。结肠中SCFAs主要由肠道微生物发酵碳水化合物产生，乙酸、丙酸和丁酸占所有SCFAs的90%~95%[32]。本试验中，添加TA可以增加乙酸、丙酸和丁酸含量，表明TA对发酵具有积极效果。BCFAs可能由蛋白质发酵产生，同时伴随氨、苯酚、对甲酚和BA分子产生，会对肠道环境细胞造成损伤。BCFAs对糖脂代谢具有调节作用，表明TA可以提高饲料能量的利用率[33]。本研究中，TA可能促进肠道微生物对发酵碳水化合物和蛋白质的发酵过程，增加SCFAs和BCFAs含量。肠道中乳酸和酪胺可以由乳酸菌产生，酪胺可通过酪氨酸脱羧酶合成[34]。本研究中，TA对乳酸和酪胺的影响不大，表明TA对乳酸菌的影响较小。肠道内色胺由梭状芽孢杆菌和瘤胃球菌转化色氨酸产生[35-36]。革兰氏阳性菌和阴性菌均可以对组氨酸进行脱羧产生组胺[37]，12 h后高浓度TA显著增加色胺产量，高浓度TA可能显著增加组胺产量，表明高浓度TA可能增加梭状芽孢杆菌和瘤胃球菌等肠道菌群的繁殖。亚精胺是一种尿毒症毒素，本试验中，TA可以有效降低亚精胺的产生。4结论本试验条件下，五倍子TA具有较强的体外抗氧化能力。在比格犬体外结肠发酵体系中添加0.125、0.250和0.500 g/L TA可以有效降低pH值，提高SCFAs和BCFAs含量，降低亚精胺含量，为TA在犬体内抗氧化和肠道代谢发酵的研究试验提供参考。