丁酸梭菌（Clostridium butyrium）属于梭菌属，被称为丁酸梭状芽孢菌和酪酸梭状芽孢菌。丁酸梭菌是革兰氏阳性菌里特有的肠道益生菌，菌体呈直杆状或稍弯曲，被鞭毛包围，产生芽孢，内生孢子呈椭圆形[1]。发酵和培养过程中，丁酸梭菌可以产生丁酸、乙酸、乳酸和丙酸，伴有少量的硫化氢和氢气生成。近年来，丁酸梭菌作为益生菌被广泛用于胃肠道疾病的临床治疗，如肠道菌群失调、药物相关性肠炎、急性和慢性腹泻、肠道应激综合征和便秘[2-3]。丁酸梭菌对畜禽肠道屏障功能具有良好的修复和增强效果，可以作为饲用微生态制剂[4]，与其他益生菌制剂相比，丁酸梭菌具有生长速度快、抗应激能力强、在肠道内持续定植等优点，能够产生有机酸和丁酸梭菌肽，在畜禽养殖业中具有良好的应用潜力。丁酸梭菌分泌的有机酸可以使肠腔pH值下降，抑制病原微生物的繁殖，减少肠道毒素，降低腹泻发生率[5]。丁酸梭菌产生的丁酸梭菌素可以杀灭和拮抗病原微生物在肠道内的定植[6]。本研究从健康的仔猪肠道中分离1株丁酸梭菌，通过16S rRNA细菌测序比对、生化鉴定系统确定其物种和亲缘关系，研究其生长特性、产酶特性、抗逆性、耐药性、抑菌性能以及对小鼠的致病性等生物学特性，为进一步筛选优良的、畜禽可以利用的菌种提供参考。1材料与方法1.1试剂、菌株和培养基强化梭菌培养基（RCM）购自青岛海博生物；琼脂粉（Agar）购自上海国药集团；细菌DNA抽提试剂盒、聚合酶链式反应（PCR）扩增试剂盒均购自上海生工生物工程股份有限公司；抗生素药物敏感纸片、细菌生化鉴定管购自杭州微生物有限公司。猪源大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和产气荚膜梭菌均由本公司分离和保存。1.2引物细菌16S rRNA基因通用引物：上游引物F1：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，下游引物F2：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。1.3测定指标及方法1.3.1细菌分离、鉴定参照文献[7]方法并加以改良，使用粪便采样器无菌采集健康自主的猪新鲜粪便，利用0.85%生理盐水经3次反复漂洗混匀、离心，依次10倍比稀释，挑选不同稀释梯度的稀释液涂布于RCM琼脂培养基平板，厌氧培养箱37 ℃培养14~16 h，在体视显微镜下挑选单菌落转接于RCM琼脂培养基平板纯化。挑取经纯化的单菌落接种RCM液体培养基，37 ℃厌氧过夜培养，取菌液提取基因组采用细菌16S rRNA通用引物进行PCR扩增。将扩增得到的PCR产物送至上海生工生物工程股份有限公司测序，与GenBank已公布的相关序列进行比对。1.3.2生化、药敏试验对JBH-1分离株进行全自动微生物鉴定仪鉴定。参照文献[8]，依据《伯杰细菌手册》介绍的丁酸梭菌生理生化特性，对JBH-1丁酸梭菌分离株进行生化、生理指标和抗生素敏感性鉴定。1.3.3生长特性和产酸能力挑取JBH-1单菌落接种于RCM液体培养基，37 ℃、220 r/min厌氧培养14~16 h，吸取适量培养液按1%比例转接于100 mL无菌的RCM液体培养基，37 ℃、220 r/min厌氧培养，每隔2 h测定细菌培养液在600 nm下的吸光度值以及pH值。1.3.4产蛋白酶特性挑取JBH-1单菌落接种于RCM液体培养基，37 ℃、220 r/min厌氧培养14~16 h，吸取适量培养液按1%的比例转接于100 mL无菌的RCM液体培养基，37 ℃、220 r/min厌氧培养14~16 h。取2 mL菌液5 000 r/min离心15 min。参照文献[9]采用福林酚法建立酪氨酸标准曲线，测定JBH-1蛋白酶活力。1.3.5抗逆性检测耐高温检测：取JBH-1的新鲜培养液于250 mL锥形瓶中，85 ℃水浴加热10 min，分别于水浴加热前、加热5 min和10 min时取样，测活菌数并计算存活率。耐酸检测：按1%的接种量将JBH-1分别接种于pH值1.0、2.0、3.0的含有无菌磷酸缓冲液的试管，37 ℃厌氧培养箱中培养，分别于0、1、2、3 h进行活菌计数，计算存活率。耐胆盐检测：按1%的接种量将JBH-1分别接种于含质量分数为0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、1.0%猪胆盐的RCM液体培养基，培养36 h，计算存活率。1.3.6抑菌特性检测参照文献[10]方法，使用经高温高压灭菌的医用棉签蘸取猪源大肠杆菌、鼠伤寒沙门细菌、金黄色葡萄球菌以及A、C型产气荚膜梭菌5种病原菌株均匀涂布于RCM平板，使用1 mL枪头（外径：9 mm）在营养琼脂和RCM平板上打孔，火焰封底。吸取200 μL JBH-1发酵液加入相应孔内。将加过样品的培养皿放入4 ℃的冰箱静置2 h，移入37 ℃培养箱，产气荚膜梭菌平板厌氧培养12 h，测量记录平板中的抑菌圈直径，判断待测样品的抑菌效果。1.4小鼠致病性试验利用无菌生理盐水连续10倍倍比稀释至合适浓度梯度，涂板计数并计算攻毒剂量。选取合适的稀释度，每个稀释度随机腹腔注射10只体重和性别一致的6周龄BAB/C小鼠，0.2 mL/只，设置生理盐水空白对照组，观察7 d，记录小鼠健康状况和存活率。2结果与分析2.116S rRNA基因序列扩增和系统发育树构建以JBH-1菌株的基因组为模板，利用细菌16S rRNA通用引物PCR扩增约1 500 bp的基因序列。经同源性比对，JBH-1株与Clostridium butyricum同源性达100%，属于丁酸梭菌。JBH-1株的16S rRNA基因进化树见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.018.F001图1JBH-1菌株的16S rRNA基因进化树由图1可知，JBH-1菌株和中国四川地区丁酸梭菌BSCBM01株（GenBank登录号：KY435713.1）聚为一簇，置信度为99%，表明二者亲缘关系最近。2.2JBH-1菌株的生化试验和药敏试验（见表1、表2）由表1可知，JBH-1菌株可以发酵利用水杨苷、蜜二糖、乳糖、半乳糖、葡萄萄、甘露醇、棉籽糖、果糖、蔗糖、海藻糖、甘露糖、木糖、纤维二糖，能够还原石蕊和硝酸盐。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.018.T001表1JBH-1菌株生理生化试验结果项目结果项目结果水杨苷+蔗糖+蜜二糖+海藻糖+松三糖-甘露糖+乳糖+木糖+半乳糖+石蕊还原试验+麦芽糖+水解淀粉试验-葡萄糖+吲哚试验-甘露醇+硝酸盐还原试验+山梨醇-水解明胶试验-棉籽糖+水解酪蛋白试验-果糖+乙酰甲基甲醇试验-纤维二糖+过氧化氢酶试验-注：“+”表示阳性；“-”表示阴性。由表2可知，JBH-1对庆大霉素、大观霉素、四环素、诺氟沙星、恩诺沙星、氧氟沙星和环丙沙星不敏感；对阿莫西林、卡那霉素、阿奇霉素中度敏感；对青霉素G、氨苄西林、头孢噻肟、头孢拉定、红霉素、头孢克洛、多黏菌素、磺胺甲氧嘧啶表现高度敏感。检索《伯杰氏细菌鉴定手册》，上述生化反应结果符合丁酸梭菌生化反应谱。全自动微生物分析仪器鉴定结果显示，JBH-1株为丁酸梭菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.018.T002表2JBH-1菌株的药物敏感试验结果药物名称含量/(μg/片)判定标准/mm结果耐药中敏敏感青霉素G10≤1414~15≥15S（17）氨苄西林10≤1314~16≥17S（21）阿莫西林10≤1314~17≥18I（16）头孢噻肟30≤1415~22≥23S（25）头孢拉定30≤1415~17≥18S（21）头孢克洛30≤1415~17≥18S（20）庆大霉素10≤1213~14≥15R（12）卡那霉素30≤1314~17≥18I（15）大观霉素100≤1415~17≥18R（11）四环素30≤1415~18≥19R（10）红霉素15≤1314~22≥23S（25）阿奇霉素15≤1314~17≥18I（17）多黏菌素200≤89~11≥12S（14）甲氧苄啶/磺胺甲恶唑23.75/1.25≤1011~15≥16S（21）诺氟沙星10≤1213~16≥17R（6）恩诺沙星5≤1316~18≥19R（6）氧氟沙星5≤1213~15≥16R（9）环丙沙星5≤1516~20≥21R（6）注：“R”表示耐药；“I”表示中度敏感；“S”表示高度敏感。2.3JBH-1菌株的生长特性和产酸能力（见图2）由图2可知，JBH-1菌株在RCM液体培养基中生长情况良好，经3~4 h进入对数生长期，菌量上升迅速，生长过程中代谢产生有机酸使培养基pH值急剧下降；JBH-1菌株对数生长期维持约8 h，进入稳定生长期，菌量不再增加，培养液OD600 nm值保持约1.7，pH值稳定为4.5~4.7。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.018.F002图2JBH-1菌株的生长曲线和pH变化曲线2.4JBH-1菌株的产蛋白酶能力（见图3、图4）由图3可知，通过福林酚法测定JBH-1菌株的蛋白酶活力结果为33.54 U/mL。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.018.F003图3酪氨酸标准曲线由图4可知，JBH-1菌株具有产蛋白酶能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.018.F004图4JBH-1菌株蛋白酶活力注：“**”表示与对照组相比差异极显著（P0.01）。2.5JBH-1菌株的抗逆特性（见图5~图7）由图5可知，JBH-1菌株85 ℃处理5 min、10 min，存活率均在95%以上。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.018.F005图5JBH-1菌株的耐85 ℃高温试验由图6可知，pH值为1.0的强酸性环境下，JBH-1株的存活率仍在95%以上。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.018.F006图6JBH-1菌株的耐酸试验由图7可知，低于0.3%的胆盐浓度下作用36 h，JBH-1菌株的存活率为95%以上，0.3%的胆盐浓度下JBH-1菌株的存活率在90%以上，0.5%和1.0%的较大胆盐浓度下JBH-1株存活率仍然在85%以上。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.018.F007图7JBH-1菌株的耐胆盐试验2.6JBH-1株对5种不同的猪源病原菌的抑菌效果（见图8）由图8可知，JBH-1株对5种不同的病原菌均具有显著的抑制作用，抑制能力大小依次为C型产气荚膜梭菌A型产气荚膜梭菌鼠伤寒沙门氏菌大肠杆菌金黄色葡萄球菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.018.F008图8JBH-1菌株对5种不同的猪源病原菌的抑菌效果2.7小鼠致病性试验小鼠毒力试验表明，无菌的PBS对照组和1.0×1010、1.0×109、1.0×108 CFU/mL 3个不同梯度攻毒的试验组小鼠均未出现死亡，且精神状态良好，饮水吃食正常，表明JBH-1菌株对小鼠不具有致病性。3讨论3.1丁酸梭菌分离、鉴定丁酸梭菌具有良好的整肠作用，在人类医疗和动物生产中得到广泛的应用和认同[11]。目前，大部分分离丁酸梭菌源自人的肠道和土壤，动物肠道中分离丁酸梭菌的报道较少。同源动物肠道内的益生菌作用于同源动物本身，能够增强益生菌本身的益生价值。因此，从动物肠道中分离筛选丁酸梭菌作为动物用益生菌制剂菌种来源具有重要意义。本研究从健康仔猪粪便中分离筛选到1株丁酸梭菌。通过微生物全自动分析鉴定仪和16S rRNA测序比对，确定其为丁酸梭菌。系统发育进化树分析结果发现，JBH-1株与中国四川地区丁酸梭菌BSCBM01株（GenBank登录号：KY435713.1）种属关系最近。Liu等[12]报道，BSCBM01株可以促进雷克斯兔生长，改善肠道微生物菌群，增强免疫功能。本试验中，JBH-1菌株可能具有相似的益生特性，仍需进一步验证。JBH-1菌株与谢树贵[13]在酒窖底泥中分离的丁酸梭菌的生化鉴定结果一致。3.2丁酸梭菌抗逆性药物敏感试验结果表明：JBH-1株对β-内酰胺类、大环内酯类和磺胺类表现敏感，在饲料生产和临床中不宜配伍；JBH-1株对氨基糖苷类、四环素类以及喹诺酮类药物耐受力较强，可以配伍，与Isa等[14]的研究结果一致。可能因为这类抗生素无法穿透丁酸梭菌的细胞壁作用于核糖体，无法发挥杀菌作用。作为非洲猪瘟常态下的防控手段之一，饲料高温热化技术被越来越多地应用于饲料生产行业[15]。本研究中，85 ℃处理10 min，JBH-1菌株存活率仍在90%以上，表明JBH-1菌株可以抵抗饲料制粒过程的高温高热，有望作为饲料添加剂使用。亓秀晔等[16]分离到的丁酸梭菌在0.4%猪胆盐中培养24 h后存活率仅为19.1%，JBH-1菌株在1.0%的猪胆盐中培养36 h后存活率仍有80%以上，表明JBH-1菌株能够在不利环境中存活较长时间。本试验在体外环境中进行的，不足以代表体内真实的胃肠转运过程，针对JBH-1菌株在体内能否耐受胃酸和胆汁的生物学特性尚需进一步研究。3.3丁酸梭菌肠道益生特性本试验中，JBH-1菌株在RCM培养基中3~4 h即可进入对数生长期，表明菌株可能具有在肠道中快速繁殖的能力进而发挥其益生作用。产酸基本在培养12 h后趋于稳定，与高文文等[17]研究结果基本相似。产酶试验表明，JBH-1菌株可以产生蛋白酶，在动物生产中应用可以提高动物的消化性能，从而提高饲料利用率。JBH-1菌株对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和产气荚膜梭菌的抑制试验表明，菌株对4种肠道常见致病菌均具有一定的抑制效果，对C型产气荚膜梭菌抑制作用最明显，与曹广添等[18]报道的丁酸梭菌对魏氏梭菌体外抑制结果基本一致。本试验中，JBH-1菌株对大肠杆菌也具有明显的抑菌作用。Yang等[19]报道，饲喂丁酸梭菌可以明显降低岭南黄肉鸡盲肠中的大肠杆菌数量。桂国弘[20]报道，丁酸梭菌早期干预大肠杆菌攻毒的肉仔鸡盲肠菌群结构，这些体内试验结果和JBH-1菌株的体外抑菌试验结果相对应，表明JBH-1株有一定的益生作用。小鼠毒力试验中，采用1.0×1010 CFU/mL的高剂量菌液腹腔注射小鼠后，小鼠未死亡，表明该菌株具有较好的安全性。4结论本研究成功从健康仔猪体内分离到1株丁酸梭菌JBH-1，分离株具有较好的生长、抗逆特性、抑菌作用和小鼠安全性等，可以作为畜禽用益生菌制剂的储备菌株。