角质蛋白是哺乳动物和家禽皮、毛、角质、喙和羽毛能够起保护性的基质中的主要蛋白质[1]。角蛋白的形成是细胞分化过程中的一部分[2]。真皮层能够在激素调节下，供应许多有需要的营养物质，调节、控制表皮细胞的分化和角蛋白的生成。奶牛具有健康的皮、毛和角质主要是依赖表皮细胞正常的角质化过程和程序性细胞死亡[1]。角蛋白形成过程中，细胞的营养供应不足或完全中断时，会形成较差的角化组织（角质），可能会出现蹄部障碍的风险，造成肢蹄病发病概率增加[3]。微量元素在生成和维系健康角化组织上具有重要作用[3]。提高微量元素的生物学利用率能够改善反刍动物蹄部角化组织的完整度[4]。微量元素在蹄角质的正常发育和修正角蛋白形成中发挥重要作用。文章综述微量元素对角质化过程的影响，为微量元素在反刍动物蹄部角化组织中的应用提供参考。1肢蹄病奶牛群体中有超过30%的牛患有不同程度的蹄叶炎。肢蹄病会给养殖经济带来损失[5]。与乳房炎相比，肢蹄病能够使每头牛产奶量降低约45 kg[6]。肢蹄病是由各种相关联的因素造成的，这些因素会在不同程度上造成蹄部角化组织损伤[7]。蹄叶炎能够导致低质量的角质，是奶牛中最常见的病症（特别是泌乳奶牛）[8-9]。所有发生在蹄骨和趾囊表皮间的敏感真皮层结构上的损伤统称为蹄叶炎[5,10]。低质量角质是由于角蛋白（蹄或趾结构蛋白）合成受损，角蛋白受损可能是与营养素普遍减少或完全缺乏、蛋白合成的化学结合受到干扰有关，从而导致赋予角的大分子组织退化，造成角本身的拉伸强度不足[5]。2角质蛋白的形成角蛋白是由动物外皮或身体外层覆盖物的表皮细胞生成的一种物质，通常具有两种质地，纤维质地（角蛋白纤维）或无固定形式蛋白质的非纤维质地（中间纤维结合蛋白质）[11-12]。角蛋白最主要的功能是向皮、毛和角提供一个易曲折、不易溶解、不起化学反应的屏障，从而抵御环境中的不利因素。表皮的纤维结构蛋白统称为角蛋白，是一个复杂的多种蛋白质混合物。角质化过程是一个单纯的退化过程，角蛋白是干燥退化或死亡的表皮细胞的产物。研究表明，表皮细胞通过高度特定的细胞过程，产生的一种具有特定物理和化学性质的蛋白质，即为角蛋白[13-16]。核糖核酸、脱氧核糖核酸、抗坏血素、游离醛基团、碱性磷酸酶、脂质、糖原和谷胱甘肽[1,5]是存在于表皮角质化细胞中的物质，其与角质化过程具有正向关系，可以判断细胞的活跃程度，通过测定血液中这些物质含量可以判断牛表皮角质化细胞的活跃程度。真皮层是对表皮构成的一个支撑性、联结性的组织层，包括血管和神经。真皮的主要纤维性蛋白是胶原蛋白和弹性蛋白。真皮层向基底层或生发层的表皮细胞的活动提供营养和激素，生发层位于真皮的层状和乳头状表面，是发生有丝分裂的位点[12]，表皮上所有远端层的形成都是源于这些表皮细胞的增殖和分化。真皮层能够指引表皮细胞的分化过程。Larson等[17]研究表明，在马蹄的急性蹄叶炎早期阶段，只在表皮发生了组织病理学的改变，但毛细血管和结缔组织在这一阶段依然保持完整。Hendry等[5]对患有层状损伤的奶牛进行组织学检验，发现在真皮薄层的微脉管系统发生明显改变。Mulling等[10]发现，急性层状损伤发生时，真皮层血管系统的改变会中断细胞分化，最终产生质量较差的角质。角蛋白在细胞内形成，负责角蛋白的合成的表皮细胞称为角化细胞[14]，在不成熟的角化细胞的胞质内可以看到残留的线粒体和核糖体，在角化细胞越来越稠密时，细胞内的原纤维的含量急剧增加[18]；当细胞继续向颗粒层移动时，在细胞质内出现大量嗜碱性体，被称为透明角质颗粒[18]。细胞向外扩展，在角质层细胞内有一个转变，这些细胞胞质充满角蛋白，而细胞核和所有胞质内细胞器和物质均消失，当存在于分子间的连接形成且角化细胞死亡时，就是表皮细胞分化的最终阶段，积累大量角蛋白纤维。在角质化过程中需要生产角蛋白替代大部分细胞内容物，而角蛋白的大分子组织形式为张力丝，张力丝与中间丝结合蛋白融合形成细胞骨架[7,19-20]。矿物微量元素对角蛋白合成过程中的特定生化通路有关，蹄部的结构强度和恢复水平均与角蛋白有关，因此矿物微量元素在决定蹄部结构强度中具有重要作用[18]。关键微量元素，如锌、锰和铜，是大量酶的关键辅助因子，其中包括很多参与角蛋白产生过程的酶。因此，微量元素与蹄部健康间存在着关联[14-15]。3微量元素对角质的作用3.1锌对角质的作用锌是角化过程中的关键元素[3,21-22]，是细胞内含量最多的微量元素，也是200多个酶系统的成分，在角质化过程中的3个关键功能（催化、结构和调控）中发挥作用[23]。RNA转移酶、RNA聚合酶、碱性磷酸酶、羧肽酶、乙醇脱氢酶和碳酸酐酶在表皮细胞角化过程中具有催化作用[23-24]。这些催化酶是锌的金属酶，因此，锌是酶的激活剂，能够使角化细胞分化过程完整。锌在表皮细胞角化过程中、结构蛋白生成中起关键作用。锌指蛋白涉及一些要求蛋白质间相互作用的功能，能够影响细胞分化和增殖[23]，如视黄酸受体和骨化三醇（1,25-二羟胆钙化醇）受体[23]。锌指蛋白的结构为-C-X2-C-Xn-C-X2-C-，C为半胱氨酸，X为其他氨基酸。Fraser等[1]发现，在哺乳动物硬角蛋白的α-螺旋链上最多的五肽序列是半胱氨酸-谷氨酰胺-脯氨酸-（丝氨酸，苏氨酸）-半胱氨酸，常出现半胱氨酸的位置可能形成β弯曲构象，由半胱氨酸残基间的一个二硫键固定。因此，锌含量不充足会导致锌指蛋白减少，而在发育角化细胞时需要形成角蛋白纤维，因此缺乏锌会导致角蛋白纤维生成不足。锌在细胞分化（包括角化细胞的分化）中具有调控作用。锌对钙调蛋白、蛋白激酶C、甲状腺激素结合酶、肌醇磷酸酯的合成等均具有调控作用[24]。钙调蛋白负责结合二价钙离子并运送其进入已激活细胞的胞液内，对角化细胞发育的最后阶段具有重要作用。钙能够激活表皮上的谷氨酰胺转移酶，而蛋白激酶C负责蛋白的磷酸化，调控能量供应。因此锌通过对二价钙离子和蛋白激酶C的调控，进而影响细胞分化过程。甲状腺激素具有调控钙调蛋白和蛋白激酶C的作用，磷酸肌醇通过调动细胞内（主要是内质网上）储存的离子提高二价钙离子。锌也具有激活胞质酶（Cu/Zn SOD）的作用。铜在Cu/Zn SOD催化位点发挥功能，而锌在酶的3D结构上发挥作用[23]。Cu/Zn SOD的作用是预防脂质的过氧化反应[25-27]，可以对细胞间胶凝物质进行保护，这种保护在维护角质的结构完整和生物功能方面具有重要作用[3,28]。Mulling[22]发现，有机锌通过角组织外植体在激活和调控角蛋白的生成上发挥重要作用。因此，饲喂有机形态的微量元素可以在最大化产奶量的同时，改善奶牛机体健康。Baggott等[29]研究发现，有蹄病的牛比没有蹄病史的牛蹄趾中锌含量低，牛蹄趾质地更软。角化细胞发育的过程中，锌含量不足或缺乏充足血液供应会导致奶牛发生肢蹄问题的可能性增高。当牛饲喂2~3 g/d硫酸锌70 d后，蹄病发病率明显降低[30]。但在绵羊日粮中补充6 mg的硫酸锌，并没有降低蹄病的发病率[27]。造成差异的原因可能是饲粮中微量元素间的拮抗作用影响了锌的生物利用率[24]。研究表明，有机形式的锌，如蛋氨酸锌，比无机形式的锌具有更高的生物利用率[31]。也有研究发现，在跛足牛的血清和毛上检测到更少的锌含量[32]。螯合锌能够改善肢蹄的完整度。在每头奶牛饲粮中添加200 mg/d蛋氨酸锌，发现蛋氨酸锌明显降低了腐蹄病、蹄后跟裂缝、趾间皮炎和蹄叶炎的发病率[33]。给牛饲喂螯合氨基酸锌后，牛的溃疡和白线病等（角化不良，角组织结构改变的迹象）具有改善趋势[34]。对每头肉牛每天补充216 mg螯合锌，发现腐蹄病的发病率在2.45%，而不补充饲喂螯合锌的肉牛腐蹄病发病率为5.38%[35]。表明饲喂螯合氨基酸锌能够改善蹄角质和皮肤的完整度，从而提高动物福利和生产性能。不同泌乳阶段奶牛对锌的需求量不同[24]。泌乳早期奶牛对锌的需求量最高[24]。在围产期和泌乳期，如果不能饲喂足量的生物利用率高的锌，可能使奶牛更容易产生质量低下的角质组织，从而增加患有肢蹄病的概率。3.2铜对角质的作用铜在对酶的激活方面具有与锌相似的作用。铜能够参与细胞色素氧化酶、赖氨酰基和硫醇氧化酶、血浆铜蓝蛋白、过氧化歧物酶的激活[24]。角质化过程中，角质细胞最重要的是硫醇氧化酶的激活[28]。硫醇氧化酶负责在半胱氨酸残基和角蛋白纤维间形成二硫键[28]，而铜参与激活硫醇氧化酶的过程，对细胞层面的结构强度具有关键作用，能够给角质化细胞一定的硬度。亚临床铜缺乏症的奶牛更容易出现蹄后跟裂缝、腐蹄病和足底脓肿等肢蹄病症[36]，可能与细胞色素C氧化酶的激活不足有关，进而降低呼吸和氧化磷酸化作用，导致供应角质细胞分化过程的能量不足[29]。用于激活Cu/Zn SOD可以利用的铜含量不足会导致Cu/Zn SOD合成不足，进而导致牛后跟容易出现裂缝和脓肿。细胞周围的不饱和脂质容易受到氧化破坏，Cu/Zn SOD具有阻止脂质氧化的功能，如果Cu/Zn SOD的活性降低，会增加细胞膜脆性[29]。细胞间脂质是胶结物质的组成部分，而胶结物质负责细胞间黏附[30]。因此，缺乏铜元素会导致产生低劣的细胞间胶质或让动物受到大量氧化破坏，从而产生角化不良的角质组织，增加了蹄趾裂开和受损的可能性。铜离子与一个氨基酸结合的有机铜形式的氨基酸铜比无机硫酸盐形式的铜的生物利用度高[37-40]。因此，有机铜可以改善奶牛角质化组织。给奶牛饲喂有机形式的微量元素能够降低蹄病的发病率[38]。3.3硒对角质的作用硒是谷胱甘肽过氧化物酶的组成成分。谷胱甘肽过氧化物酶负责将过氧化氢和自由氧气转化为水[24]。因此，谷胱甘肽过氧化氢酶能够保护细胞内和细胞外的脂质膜，抵御氧化破坏。硒可能对富含脂质的细胞间胶凝物质的生理功能起保护和维持作用。硒和蹄部张力强度具有正向关系。硒可以连接角蛋白，阻止氧化破坏，进而保护角质结构[41]。硒保护并维持角质化细胞间胶质成分大部分为脂质[42-43]。过量补充硒可能破坏角化细胞发育。当硒以硒代蛋氨酸的形式添加时，硒元素能够以蛋氨酸形式被快速吸收[31]。无机硒的吸收率很高（大于50%），但无机硒的吸收不容易被调节控制，可能会对奶牛生产性能造成负面影响[44]。体内储存的硒，无机形式来源为亚硒酸盐或硒酸盐，氨基酸硒形式为硒代半胱氨酸或硒代蛋氨酸[45]。研究发现，生物学效价最高的形式是硒代蛋氨酸，其次是硒代半胱氨酸。Combs等[31]研究发现，在蛋白质生产过程中，硒或硒代氨基酸可能优先结合需要AA位点的硫，进而改变蛋白质结构完整度。Larson等[40]发现，在干奶期对牛注射50 mg的硒（NRC标定的需求量的6.6倍），会导致牛在产后患有严重的肢蹄病；补充注射硒后，48%~69%的牛出现肢蹄病、蹄痛、畸形蹄和尾巴掉毛现象，但未补充注射硒的牛中只有28%~30%牛出现了肢蹄问题，可能是因为补充过量硒后，牛成熟的角质细胞的角质纤维上的关键半胱氨酸和蛋氨酸位点被硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸所取代，降低了关键二硫键的形成或抑制了角质化过程，产生缺乏结构硬度的劣质蹄角质，造成蹄完整度不足。奶牛饲粮中硒的推荐剂量为0.3 mg/kg DM，特别是在干奶期或泌乳早期，需要防止过量添加[46-50]。3.4锰对角质的作用锰在角质化过程中起间接作用。锰对动物结构蛋白的形成方面具有重要作用，在维持适宜和坚固的腿部结构方面起一定作用，从而改善奶牛的蹄部问题[51-53]。锰被机体用于激活半乳糖转移酶和糖基转移酶，这两种酶在蛋白质多糖分子的硫酸软骨素侧链合成方面起作用[24,37]。蛋白多糖对构成正常的软骨和骨构件的形成起关键作用。体内缺乏锰的动物会出现骨骼畸形、腿弯曲、缩短肌腱以及蹄有明显的突球部[24,54-57]。锰也在激活其他关键酶系统上发挥作用，如丙酮酸羧化酶是用于催化碳水化合物合成的第一步，这个过程负责糖原异生并产生细胞能量，是产生高质量角质组织一种必需成分[33]。锰在Mn SOD激活上起作用，能够去除超氧自由基。因此，Mn SOD可能在保护成熟细胞间的胶凝物质上起作用。3.5微量元素的组合对角质的作用微量元素间具有非常明显的相互作用，因此，需要制定合理的营养配方比例保持微量元素间的平衡，最大限度地发挥动物的生产性能。研究发现，由于协同效应，补充组合型微量元素比单一的元素对蹄部的完整性效果更好。研究发现，在奶牛日粮中补充360 mg有机锌、200 mg有机锰、125 mg有机铜、25 mg有机钴比日粮中只添加360 mg有机锌或不添加有机微量元素奶牛，蹄部完整度更好[34]。在日粮上补充复合有机微量元素能够减少蹄底扭曲、白线分离、蹄趾皮炎、足底出血以及足底溃疡的发生率[58-60]。Ballantine等[4]研究补充有机锌、锰、铜和钴的复合微量元素评估微量元素对蹄部健康的影响，结果发现，产后第75 d，饲喂复合有机多矿比饲喂无机微量元素的奶牛畸形蹄的发病率降低（23.6%VS34.1%）；产后250 d，畸形蹄的发病率更低（10.0%VS17.7%）；饲喂有机微量元素显著降低了产后第75 d（9.5%VS14.6%）和第250 d奶牛白线病的发病率（4.9%VS8.8%）。因此，在干奶后期和泌乳早期饲喂有机微量元素有改善奶牛蹄部损伤评分的趋势，从而提高奶牛蹄部健康和完整度。4展望营养是与牛跛足最相关的因素之一，也是奶牛生产中重点关注的内容，能够影响动物健康和福利。角质的生长是一个复杂的过程，需要组氨酸、蛋氨酸、矿物质、维生素、矿物质等多种营养元素，矿物质中对钙、锌的含量指标最为敏感。因此，设计能够促进牛角质生长、提高机体抗氧化能力、抑制酸中毒的有机复合多矿对实现奶牛最大化产奶量、维持奶牛健康有利。目前，关于有机复合微量元素（羟基蛋氨酸盐、水解蛋白盐等）在奶牛肢蹄健康方面的研究较少，这些有机复合微量元素是否对不同时期（泌乳期，干奶期，围产期）奶牛关于蹄发育方面的相关基因（KRT5、CALML5、CYBB等）的表达具有一定的相关性，是否对某些病菌的感染或其他的导致蹄部发病的病因有阻碍作用，可能是未来需要关注的方向，需要根据奶牛泌乳量、生长阶段以及不同地区的营养条件设计日粮配方，推导出最优化的微量元素配方。