生长育肥猪肠道健康对保障生猪健康、生产性能起重要作用[1]。2020年7月1日起，全面禁止在饲料中添加抗生素。因此，需要寻找无残留、安全绿色的方法改善畜禽的生产性能，增加养殖收益。微生态制剂能够从健康个体中分离得到，具有免疫调节、对共生细菌和病原菌发挥干预作用、对肠道稳态起修复作用[2]。微生物发酵饲料是通过向饲粮中添加一种或多种有益微生物对饲粮起发酵作用，使饲粮中富含更多的活性益生菌菌体、有益代谢产物、有机酸和可溶性多肽等小分子物质，从而提高机体对营养物质消化利用率，消除饲粮中部分抗营养因子[3-4]。因此，本试验以生长育肥期莱芜黑猪为试验对象，研究微生物发酵饲料对其生长性能、氮磷排放、肠道消化酶活性和盲肠微生物的影响，以期为微生物发酵饲料在育肥猪生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料微生态制剂（乳酸杆菌≥1.5×107 CFU/g、枯草芽孢杆菌≥1.5×107 CFU/g、酿酒酵母菌≥1.2×107 CFU/g）由青岛根源生物技术集团有限公司提供。1.2试验设计选取64头平均体重约70 kg健康的莱芜黑猪，随机分为2组，每组8个重复，每个重复4头猪。微生态制剂组在基础饲粮中添加0.2%的微生态制剂，微生物发酵组在基础饲粮中添加0.2%微生态制剂和30%水混匀发酵，于37 ℃发酵2 d。参照《猪饲养标准》营养需要配置粉状配合饲料。试验饲粮组成及营养水平见表1。试验期70 d。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.004.T001表1试验饲粮组成及营养水平（风干基础）原料组成/%微生态添加组微生物发酵组营养水平微生态添加组微生物发酵组合计100.000100.000玉米62.00062.000代谢能/(MJ/kg)13.508.84豆粕18.00018.000粗蛋白质/%16.1010.55玉米胚芽饼15.00015.000钙/%0.660.43豆油1.0001.000有效磷/%0.320.21石粉1.0501.050赖氨酸/%0.760.50磷酸氢钙1.0001.000蛋氨酸/%0.420.2870%赖氨酸0.3500.350蛋氨酸+胱氨酸/%0.650.43DL-蛋氨酸0.0800.080苏氨酸/%0.610.1098%苏氨酸0.0600.060色氨酸/%0.180.1160%氯化胆碱0.0800.080植酸酶（5 000 IU/g）0.0300.030维生素预混料0.0300.030微量元素预混料0.1500.150复合酶制剂0.0200.020食盐0.3500.350甜味剂0.0250.025沸石粉0.5750.575微生态制剂0.2000.200注：1.维生素预混料为每千克饲粮提供：VA 2 000 IU、VD3 200 IU、VE 15 mg、VK3 0.5 mg、硫胺素1.2 mg、核黄素3.5 mg、吡哆醇1.5 mg、泛酸10 mg、烟酸15 mg、VB12 18 μg、生物素0.08 mg、叶酸0.3 mg。2.微量元素预混料为每千克饲粮提供：铜（CuSO4∙5H2O）6 mg、铁（FeSO4∙H2O）80 mg、锰（MnSO4∙H2O）5 mg、锌（ZnSO4∙H2O）100 mg、碘（CaIO3）0.15 mg、硒（Na2SeO3）0.30 mg。3.营养水平中粗蛋白质为实测值，其余均为计算值。1.3饲养管理所有莱芜黑猪单栋饲养，自由采食，每天8：00和16：00定时饲喂，自动饮水器供水，保证自由饮水。按正常免疫程序进行免疫接种。每天记录试验猪的采食量和健康状况，保持圈舍卫生与干燥。1.4测定指标及方法1.4.1样品采集试验结束前10 d，每个重复收集新鲜粪便约300 g于干净塑料盆中，加入30 mL 10%稀硫酸固氮，加入2滴甲苯防腐，装入自封袋编号，-20 ℃冰箱保存，测量粪中氮与磷含量。试验结束时，每个重复选择1头猪屠宰。黑猪经颈静脉放血处死，抛开腹腔，找到小肠部分，使用细线结扎，获得十二指肠、空肠、回肠食糜，一部分用于测量食糜pH值；另一部分装入离心管中，-20 ℃冰箱保存，用于测定淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶活性。对回肠与结肠结合部位进行结扎，获得盲肠食糜，用于测量盲肠内微生物区系。1.4.2生长性能试验开始前与结束后分别称量黑猪体重，计算莱芜黑猪平均日增重，记录试验过程中黑猪采食量，计算平均日采食量和料重比。考虑微生物发酵饲料组水分含量较高，对干物质摄入量造成分析干扰，试验按照干物质含量87%进行适当换算，统计生长性能差异。平均日增重=(末重-初重)/试验天数(1)平均日采食量=每组采食量/(试验天数×试验头数)(2)料重比=平均日采食量/平均日增重(3)1.4.3粪中氮与磷含量粪样在常温下解冻，于105 ℃快速烘干1.5 h，室温放置至常温，使用粉碎机粉碎，制成风干样品，使用凯氏定氮仪法测定粪中氮含量，使用钒钼酸铵法测定粪中磷含量，具体测量方法按照张丽英[5]方法进行。1.4.4小肠pH值屠宰过程中，去除少量食糜，按1∶9加入去离子水稀释，使用玻璃棒搅拌充分混合5 min，使用PHS-3E（数显）pH计测定十二指肠、空肠与回肠食糜pH值。1.4.5肠道消化酶活性分别将肠道食糜样品从冰箱中取出，室温解冻，取少量食糜，加入双蒸水[食糜质量（g）∶水体积（mL）＝1∶5]，摇匀，4 ℃、3 000 r/min离心5 min，取上清液，使用试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶活性，具体操作按照试剂盒说明书进行，使用BCA法测定上清液蛋白含量。1.4.6盲肠微生物数量盲肠微生物测定采用平板涂布法计数，取盲肠食糜0.5 g，加入灭菌生理盐水4.5 mL稀释为10-1悬浊液，漩涡振荡3 min，离心5 min，吸取0.5 mL上清液加入盛有4.5 mL灭菌生理盐水试管中稀释至10-2悬浊液，按照此方法依次将空肠和盲肠内容物稀释至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7用于涂板培养。乳酸杆菌采用Rogasa琼脂培养基37 ℃恒温培养箱冲氮气进行厌氧培养48 h；大肠杆菌采用麦康凯培养基（MacConkey琼脂）37 ℃恒温培养箱培养24 h分别计数；沙门氏菌采用HE琼脂平板法在37 ℃恒温培养箱中培养24 h。结果以每克肠道内容物中含有菌落总数的常用对数lgCFU/g表示。1.5数据统计与分析试验数据采用Microsoft Excel初步处理，SPSS 18.0进行统计分析，通过单因素方差分析进行显著性检验，Duncan's法多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1微生物发酵饲料对莱芜黑猪生长性能的影响（见表2）由表2可知，微生物发酵组莱芜黑猪的平均日增重、平均日采食量高于微生态制剂组（P0.05），料重比低于微生态添加组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.004.T002表2微生物发酵饲料对莱芜黑猪生长性能的影响组别初重/kg末重/kg平均日增重/[g/(头·d)]平均日采食量/[g/(头·d)]料重比微生态添加组70.37±6.93100.67±8.24432.82±29.611 783.45±92.764.13±0.26微生物发酵组70.62±6.68103.42±9.04468.56±30.651 867.34±96.424.02±0.34注：同列数据肩标无字母表示差异不显著（P0.05）；表3、表4、表6与此同。2.2微生物发酵饲料对莱芜黑猪氮磷排放的影响（见表3）由表3可知，与微生态添加组相比，微生物发酵组莱芜黑猪粪便中氮含量显著降低（P0.05），粪便中磷含量降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.004.T003表3微生物发酵饲料对莱芜黑猪氮磷排放的影响组别粪便氮含量粪便磷含量微生态添加组2.98±0.14a1.86±0.12微生物发酵组2.61±0.11b1.67±0.14注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。%2.3微生物发酵饲料对莱芜黑猪肠道pH值的影响（见表4）由表4可知，与微生态添加组相比，微生物发酵组莱芜黑猪十二指肠、空肠pH值降低，回肠pH值升高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.004.T004表4微生物发酵饲料对莱芜黑猪肠道pH值的影响组别十二指肠空肠回肠微生态添加组6.56±0.146.67±0.176.88±0.23微生物发酵组6.31±0.246.59±0.196.96±0.252.4微生物发酵饲料对莱芜黑猪肠道消化酶活性的影响（见表5）由表5可知，与微生态添加组相比，微生物发酵组莱芜黑猪的十二指肠内淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性显著升高（P0.05），莱芜黑猪空肠内淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性显著升高（P0.05），莱芜黑猪回肠内蛋白酶活性显著升高（P0.05），回肠内淀粉酶和脂肪酶活性升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.004.T005表5微生物发酵饲料对莱芜黑猪肠道消化酶活性的影响组织项目微生态添加组微生物发酵组十二指肠淀粉酶/(U/mg prot)2.58±0.21b3.34±0.31a脂肪酶/(U/g prot)57.69±5.34b67.07±5.86a蛋白酶/(U/mg prot)169.46±15.72b246.74±20.61a空肠淀粉酶/(U/mg prot)2.69±0.19b3.64±0.27a脂肪酶/(U/g prot)61.31±5.95b73.13±6.97a蛋白酶/(U/mg prot)178.49±15.96b260.85±23.86a回肠淀粉酶/(U/mg prot)3.88±0.354.26±0.32脂肪酶/(U/g prot)48.26±4.0755.25±4.86蛋白酶/(U/mg prot)168.64±14.31b208.91±18.67a注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。2.5微生物发酵饲料对莱芜黑猪盲肠微生物的影响（见表6）由表6可知，与微生态添加组相比，微生物发酵组莱芜黑猪盲肠内大肠杆菌和沙门氏菌数降低，乳酸杆菌数增加降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.004.T006表6微生物发酵饲料对莱芜黑猪盲肠微生物的影响组别大肠杆菌沙门氏菌乳酸菌微生态添加组5.58±0.274.37±0.265.84±0.22微生物发酵组5.32±0.344.09±0.236.16±0.25lgCFU/g3讨论3.1微生物发酵饲料对莱芜黑猪生长性能的影响益生菌是抗生素的理想替代物[1]。胡新旭等[6]和周映华等[7]使用乳酸菌、酿酒酵母菌和枯草芽孢杆菌按1∶1∶1组成的复合微生态制剂发酵饲料，结果发现，断奶仔猪的生长性能和育肥猪的生长性能均提高。Xu等[8]研究表明，使用发酵饲料能够改善猪的生长性能，与本试验结果一致。微生物发酵饲料能够提高猪生长性能的原因可能与益生菌增殖过程产生的淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶有关[6]，也有可能与微生物发酵饲料能够增加饲粮发酵酸香味，改善饲粮适口性有关[7]。朱坤[9]使用唾液乳杆菌∶枯草芽孢杆菌∶酿酒酵母比例为2∶2:∶1发酵饲料，结果表明，接种微生物发酵能够提高饲粮中有益菌及丙酸含量，改善饲粮品质。Yang等[10]研究发现，使用枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌和乳酸菌发酵的固体形态发酵饲料，结果发现，“杜×长×大”三元杂交猪的生长性能明显改善。Missotten等[4]研究发现，发酵饲料能够提高猪的生长性能，可能与发酵能够增加了饲粮中抗微生物生长促进物（AMGP）含量、增强了胃的消化潜力及胃预防致病性感染的第一道防线功能有关。这种胃预防致病性感染防线与减少有害致病菌（如沙门氏菌的增殖）有关，也与相关微生态制剂与发酵底物相互作用产生一些对机体有益的物质有关[11]。Yang等[10]研究发现，发酵饲料能够提高血清中IGF-1含量与肝脏中IGF-1表达丰度。3.2微生物发酵饲料对莱芜黑猪氮磷排放的影响李金库等[12]研究表明，微生物发酵饲料能够降低畜禽粪便中氮磷的排放量，间接改善养殖场环境。Choi等[13]研究表明，益生菌能够减少猪粪便中氮含量，进而降低养猪场育肥期臭味，与本试验的结果相一致。结合本研究内容，推测发酵饲料降低粪便氮与磷排放与提高肠道消化酶活性、改善肠道抗氧化性能、影响盲肠微生物组成有关。3.3微生物发酵饲料对莱芜黑猪肠道pH值的影响Missotten等[4,11]研究表明，发酵作用会使添加在饲粮中的微生物增殖，产生一些代谢产物，如乳酸、丙酸、乙酸等产物，进而降低发酵饲料pH值。Canibe等[14]研究饲料发酵过程生物化学变化，结果发现，饲粮发酵初期pH值高，氧气含量高，乳酸菌和酵母菌数量少，此时主要是枯草芽孢杆菌和酵母菌进行有氧增殖，待氧气消耗后浓度逐渐降低，发酵逐渐转变为厌氧发酵，乳酸菌增殖产生乳酸。使用植物乳杆菌发酵饲料能够降低肠道pH值，由于乳酸和乙酸的产生，肠道pH值低于4.0[15]。发酵饲料降低能够饲料pH值还与饲料发酵过程中产生大量挥发性脂肪酸和有益代谢产物有关[12,16]，与本试验中使用乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌混合发酵饲料降低肠道pH值研究结果一致。3.4微生物发酵饲料对莱芜黑猪肠道消化酶活性的影响发酵饲料提高动物对饲料消化能力与肠道中自然存在内源酶的有效激活有关[17]。发酵作用增加饲料营养成分主要与饲料中能量源的发酵作用能够增加酶的活性有关，这些酶能够促进蛋白质消化作用，增加多肽的产生，降低抗营养因子含量，提高猪对营养物质的吸收[4]。Park等[18]研究表明，玉米经过微生物发酵作用，能够增加淀粉化率，降低玉米中纤维、多糖和抗营养因子，与本试验微生物发酵饲料能够增加十二指肠、空肠、回肠中相关消化酶的结果相一致。3.5微生物发酵饲料对莱芜黑猪盲肠微生物的影响周映华等[7]使用乳酸菌、酿酒酵母菌和枯草芽孢杆菌按1∶1∶1组成的复合微生态制剂发酵饲料，结果发现，生长育肥猪盲肠内乳酸菌丰度增加，盲肠内大肠杆菌和沙门氏菌丰度降低。Missotten等[4]研究表明，使用益生菌发酵饲料能够增加动物肠道内有益菌如乳酸杆菌和双歧杆菌丰度，降低有害菌如大肠杆菌和沙门氏菌丰度。朱坤[9]研究发现，使用唾液乳杆菌∶枯草芽孢杆菌∶酿酒酵母比例为2∶2∶1发酵饲料能够增加育肥猪结肠中魏斯氏菌属和柔嫩梭菌属的相对丰度，对肠道健康具有改善作用。使用益生菌发酵有利于猪肠道健康，与肠道微生态系统平衡的位置有密切关系[19]。研究发现，使用植物乳杆菌发酵饲料能够产生乳酸与乙酸，降低饲粮pH值，从而降低猪盲肠中沙门氏菌定植作用[15]，与Missotten等[11]研究结果一致。Genovese等[20]研究发现，使用健康猪盲肠培养的益生菌饲喂断奶仔猪，能够竞争性排斥抗大肠杆菌感染引起的肠毒素感染，降低死亡率17.5%，粪便中大肠杆菌数量显著降低。高侃等[2]研究表明，发酵饲料对有害菌抑制作用可能是通过调节肠道上皮屏障功能，进而减少有害菌的定植作用实现的，与本试验中使用微生物发酵饲料能够增加生长育肥猪盲肠有益菌、抑制有害菌结论相一致。4结论微生物发酵饲料增加莱芜黑猪生长性能，减少粪便氮排放，通过提高莱芜黑猪肠道消化酶活性，增加肠道有益菌丰度，减少有害菌丰度，改善肠道健康作用。