黑豆的蛋白质及赖氨酸、蛋氨酸的含量均高于其他色泽的大豆，7种必需氨基酸的含量高于FAO/WTO均衡模式标准[1]，是一种优质的蛋白质来源。黑豆占据资源优势，广泛应用于食品、化工、医药行业[2]。畜禽食用黑豆后不仅体格健壮，抗病能力也得到增强[3]。此外，黑豆也是大豆膨化饲料、大豆发酵饲料等的重要原料[4]。天门海大饲料有限公司利用黑豆、豆粕粉等发明了黑豆家畜饲料，有助于家畜快速生长，且易保存[5]；安徽天隆饲料有限公司研究了一种以黑豆为原料的猪饲料，可使猪体型标准[6]。目前关于黑豆蛋白水解肽综合利用的研究较少。研究显示，多肽具有良好的生物活性，如抗氧化性[7]、降血糖[8]、降血脂[9]、缓解骨质疏松[10]等。通常制备多肽采用酸法和酶法，酶法制备多肽较为温和。黑豆蛋白采用传统的碱液提取法存在提取效率低的问题。超声波技术强化提取可有效缩短提取时间，提高提取率，进而节约成本[11]。刘恩岐等[12]通过超滤与大孔树脂吸附方式获得具有降胆固醇含量较强的黑豆肽组分。李思锦等[13]研究发现，灌胃高脂性黑豆肽4周，可对高脂性肝损伤小鼠起到保护作用。饲料中存在大量的脂肪、糖类等高能量物质，极易氧化；而抗氧化肽具有清除自由基、抑制脂质氧合酶活性等作用，可减少饲料中脂肪的氧化，延长饲料保质期[14]。王贤勇[15]研究表明，小肽制品可提高断奶仔猪的生长性能，增强免疫机能。李丽立等[16]发现，利用小肽饲喂山羊可显著提高氮沉积、能量和钙的消化率。本研究以黑豆蛋白为原料，通过超声波辅助双酶法制备黑豆多肽，优化制备工艺，测定黑豆肽体外抗氧化活性，以期拓展黑豆多肽在饲料中的功能性开发与利用。1材料与方法1.1试验材料黑豆蛋白粉购自陕西斯诺特生物技术有限公司；碱性蛋白酶（最适pH值7~11，最适温度40~55 ℃，酶活力20 万U/g）、木瓜蛋白酶（最适pH值7~8，最适温度50~55 ℃，酶活力30万U/g），均购自上海翔洋实业有限公司。盐酸、氢氧化钠、正己烷、过氧化氢、邻苯三酚、三氯乙酸、七水合硫酸亚铁、乙醇、氯化亚铁、三羟甲基氨基甲烷等其他试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。1.2试验设备ES/EX-E万分之一电子分析天平（厦门莱斯德科学仪器有限公司）、HH-US-A恒温水浴锅（上海赫田科学仪器有限公司）、BILON-650E超声波细胞破碎仪（上海比朗仪器制造有限公司）、GL-10MC高速冷冻离心机（长沙湘锐离心机有限公司）、UPG-722紫外可见分光光度计（北京优谱通用科技有限公司）、HS-3G pH计（上海精密科学仪器有限公司）、LGJ-18冷冻干燥机（北京亚星仪科科技发展有限公司）。1.3试验方法1.3.1黑豆蛋白粉基本成分的测定粗蛋白含量的测定参照GB/T 5009.5—2003；粗脂肪的测定参照GB/T 5009.5—2003；水分的测定参照GB/T 5009.5—2003；灰分的测定参照GB/T 5009.5—2003。1.3.2黑豆蛋白多肽的制备工艺及水解度测定正己烷与黑豆蛋白粉以4∶1混合，室温搅拌1.5 h，5 000 r/min离心30 min，取上清液，风干得脱脂黑豆蛋白粉；去离子水溶解（料液比15 mL/g）得到黑豆蛋白液，预热，进行超声波预处理。加入不同比例的复合酶，调节两个酶的最适作用温度范围（结合两酶最适作用温度范围，选择最佳温度为52 ℃）和pH值（结合两酶最适作用pH值范围，选择最佳pH值为7.5），反应0.5~6.0 h，3 500 r/min离心20 min，取上清液，冷冻干燥机冻干，制备黑豆蛋白肽，-80 ℃保存。pH-stat法[17]测定黑豆蛋白的水解度。1.3.3单因素试验单因素试验以黑豆蛋白的水解度为测定表征指标，研究酶活比（1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1）、底物浓度（1%、2%、3%、4%、5%、6%）、加酶量（200、400、600、800、1 000 U/g）、超声功率（100、200、300、400、500 W）、反应时间（0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h）等5种不同因素对水解度的影响，进一步优化黑豆蛋白肽的制备工艺。1.3.4正交试验为优化黑豆蛋白多肽工艺，在单因素试验确定的最佳反应条件下，选取超声功率（A）、底物浓度（B）、反应时间（C）进行3因素3水平正交试验，见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.018.T001表1L9（34）正交试验水平A/WB/%C/h1100322200433300541.3.5正交验证试验根据正交试验得到的最佳工艺进行重复3组试验。1.3.6体外抗氧化活性测定1.3.6.1·O2-清除能力的测定参照Huang等[18]的方法。1 mL多肽样品和1.95 mL 45 mmol/L Tris-HCl （pH值为8.1）置于25 ℃水浴条件下反应10 min，加入0.15 mL 3 mmol/L邻苯三酚，于325 nm下测定吸光值，共反应4 min，每隔30 s读值，根据吸光值变化率确定邻苯三酚的氧化率（A样品），以等体积的蒸馏水（A空白）作为空白对照，计算清除·O2-能力。·O2-清除率=(1-A样品/A空白)×100%(1)1.3.6.2OH·清除能力的测定参照Wang等[19]的方法并稍加修改。于10 mL的离心管中依次加入0.2 mL 10 mmol/L FeSO4·7H2O、0.2 mL 10 mmol/L EDTA、0.2 mL 10 mmol/L 2-脱氧核糖、0.2 mL 10 g/L样品、1 mL 0.1 mol/L PBS（pH值7.4）和0.2 mL 10 mmol/L H2O2，混合均匀后于37 ℃恒温水浴锅中反应1 h，加入1 mL 2.8%三氯乙酸和1 mL 1%硫代巴比妥酸，沸水煮沸15 min后冷水冷却，于532 nm条件下检测样品吸光值（AS），以等体积蒸馏水作为对照（A0）。计算清除OH·能力。OH·清除率=(A0-AS)/A0×100%(2)1.3.6.3ABTS+·清除能力的测定参照Segura-Campos等[20]的方法并稍加修改。以去离子水配制7 mmol/L ABTS+溶液后，加入2.45 mmol/L过硫酸钾，将该溶液在室温暗环境下放置14 h。将生成的ABTS+·溶液采用磷酸缓冲液（0.2 mol/L PBS，pH值7.4）稀释为在734 nm下吸光值为0.70±0.02的溶液。取40 µL样品加入4 mL ABTS+·溶液，充分摇匀30 s，暗环境下反应6 min，于734 nm下测吸光值。不同浓度维生素C（VC）对自由基清除率（浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g/L）绘制标准曲线，标准曲线方程为：y=1 196.2x+38.2（R2=0.991 2）。样品清除结果以每克干样所含抗坏血酸当量（mg/g）表示（As），以等体积蒸馏水作为对照（A0）。计算ABTS+·清除能力。ABTS+·清除率=(A0-As)/A0×100%(3)1.4数据统计与分析试验数据采用Excel 2012软件进行统计，origin 86软件、SPSS软件进行方差分析，多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1黑豆蛋白粉主要营养成分（见表2）由表2克制，黑豆蛋白粉的粗蛋白含量为74.58%、粗脂肪含量为1.77%、水分含量为5.10%、灰分含量为5.80%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.018.T002表2黑豆蛋白粉主要营养成分项目粗蛋白（干基）粗脂肪水分灰分含量74.58±0.851.77±0.165.10±0.205.80±0.12%2.2不同因素对黑豆蛋白水解度的影响2.2.1不同酶活比对黑豆蛋白水解度的影响（见图1）试验选取了碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解黑豆蛋白。碱性蛋白酶适合水解植物蛋白[21]，木瓜蛋白酶是一种含巯基（-SH）的肽链内切酶，对动植物蛋白具有较强的水解能力[22]。由图1可知，碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶活比为7∶3时，黑豆蛋白的水解度最大，且显著高于其他酶活比（P0.05），表明在此比例下两种酶可更好地作用于各自的酶切位点，协同作用最佳，故最佳的酶活比为7∶3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.018.F001图1不同酶活比对黑豆蛋白水解度的影响2.2.2不同底物浓度对黑豆蛋白水解度的影响（见图2）由图2可知，底物浓度为4%时，黑豆蛋白的水解度最高，且显著高于其他底物浓度（P0.05）。原因可能是随着底物浓度的增大，底物和酶可充分地接触；但底物达到一定浓度后会对酶解反应产生一定的抑制作用，导致水解效率下降，故选择4%为最佳的酶反应底物浓度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.018.F002图2不同底物浓度对黑豆蛋白水解度的影响2.2.3不同加酶量对黑豆蛋白水解度的影响（见图3）由图3可知，黑豆蛋白的水解度在加酶量为800 U/g时达到最高，且显著高于其他加酶量（P0.05）。随着加酶量的升高，酶获得更多机会与底物接触，分子碰撞活跃，故选择800 U/g为双酶作用的最佳加酶量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.018.F003图3不同加酶量对黑豆蛋白水解度的影响2.2.4不同超声功率对黑豆蛋白水解度的影响（见图4）超声波的机械效应及空化效应会引起介质的一些特性变化，可促进高分子的降解和酶解反应等[23]。由图4可知，超声功率为200 W时，黑豆蛋白的水解度达到最大，且显著高于其他超声功率（P0.05）。原因可能是通过超声波处理后导致黑豆蛋白的结构疏松，利于酶与底物的充分反应，达到一定功率后对蛋白的破坏程度加大，降低了水解度，故200 W为最佳超声功率。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.018.F004图4不同超声功率对黑豆蛋白水解度的影响2.2.5不同反应时间对黑豆蛋白水解度的影响（见图5）由图5可知，黑豆蛋白水解度在反应时间为4 h时达到最大，且显著高于其他反应时间（P0.05）。原因是反应时间的延长可使酶和底物分子充分碰撞，达到一定的反应时间后，底物的特定肽键减少，导致水解度降低，故选取4 h为最佳酶解作用时间。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.018.F005图5不同反应时间对黑豆蛋白水解度的影响2.3正交试验结果（见表3）由表3可知，3种因素对黑豆蛋白水解度的影响程度为ABC（超声功率底物浓度反应时间），最佳加工工艺为A2B3C3，工艺参数为：超声功率200 W、加酶量800 U/g、底物浓度5%、反应时间4 h，水解度最高达26.8%。在此工艺参数下，超声辅助双酶作用效果最佳，有效提升了黑豆蛋白的水解度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.018.T003表3正交试验结果试验号ABC水解度/%111120.2212223.6313320.1421223.4522325.6623125.9731322.4832123.6933222.3k121.322.022.7k225.022.823.1k322.824.323.2R3.72.30.5最优组合A2B3C32.4正交验证试验结果（见表4）由表4可知，根据得到的最佳制备条件进行正交试验验证，得到的蛋白水解度为26.8%，与正交试验的结果相近，表明该工艺稳定可行。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.018.T004表4正交验证试验结果项目123平均值水解度/%27.326.226.926.82.5黑豆多肽体外抗氧化活性测定结果（见表5）由表5可知，黑豆蛋白多肽对·O2-、OH·、ABTS+·均具有一定的清除能力。李华等[24]研究显示，黑豆蛋白多肽主要是一些相对分子质量约为450~920的小肽，可缓解自由基引发的体力疲劳。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.018.T005表5黑豆蛋白多肽体外抗氧化活性测定结果项目·O2-OH·ABTS+·清除能力/%28.35±0.1553.24 ±0.2156.72±0.943结论结果显示，黑豆蛋白多肽最佳制备工艺为：超声功率200 W、酶活比7∶3、反应pH值7.5、反应温度52 ℃、加酶量800 U/g、底物浓度5%、反应时间4 h，制备出的黑豆蛋白肽对·O2-、OH·、ABTS+·具有一定的清除能力，具有体外抗氧化活性，可利用黑豆肽开发新型绿色饲料添加剂可减少抗生素使用，提高畜产品的安全性。