菲牛蛭（Hirudinari manillensis）是我国特色药用动物资源，又称金边蚂蟥，主要以吸吮人、畜血液为生，是一种吸血类医用水蛭。菲牛蛭中含有菲牛蛭素[1]、纤溶酶[2]，具有抗血小板聚集和抑菌等多种作用[3]。电泳法作为一种蛋白多肽的分析方法，具有分辨率高、灵敏度高、分析速度快、样品用量少等优点[4]。SDS-PAGE电泳能够分辨大分子蛋白，对相对分子量小，尤其是10 kDa以下的蛋白分辨率极低[5]，极易扩散丢失，无着色带。目前，Tricine-SDS-PAGE是一种有效分离小分子蛋白、多肽的电泳方法[6]。本研究建立菲牛蛭中小分子多肽的Tricine-SDS-PAGE分离方法，为菲牛蛭多肽分离方法提供参考。1材料与方法1.1试验仪器LC-20AT岛津高效液相色谱仪配博纳艾杰尔Venusil氨基酸分析专用柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）、PHS-3DpH计（上海精密科学仪器有限公司）、85-2恒温磁力搅拌器（常州国华电器有限公司）、FD-1C-50冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）。1.2试验材料菲牛蛭清洗，沥干体表水分，放入液氮中急速冷冻，高速粉碎机将冰冻的菲牛蛭击碎为粉状，冷冻干燥机冷冻干燥，粉碎制成冷冻干燥样品。基因重组水蛭素（电泳纯，纯度95%，蛋白含量10 g/L，抗凝血酶活性12 000 ATU/mg）购自大连联合博泰生物有限公司；超低分子量蛋白质Marker（3.3~20.1 kDa）购自上海索莱宝生物科技有限公司。10×阳极缓冲液（下槽缓冲液）：Tris碱121.1 g、ddH2O 400 mL，调HCl pH值至8.9，ddH2O定容至500 mL。阴极缓冲液（上槽缓冲液）：Tris碱12.11 g、Tricine 17.92 g、SDS 1 g，ddH2O定容至1 000 mL。固定液：50%乙醇、10%冰乙酸。染色液：1.5 g/L的R250考马斯亮蓝染色液。1.3测定指标及方法1.3.1样品提取采取水提醇沉方法对菲牛蛭进行粗提，称取菲牛蛭冻干粉样品约10 g，置于具塞锥形瓶中，分别加入200 mL蒸馏水充分浸泡溶解30 min，振荡30 min匀浆，细胞破碎仪破碎5 min，12 000 r/min离心15 min，过滤，取上清液。重复按此步骤提取沉淀2次，合并上清液，将此上清液浓缩1倍，加入等体积的无水乙醇，振荡30 min，12 000 r/min离心15 min，过滤，浓缩样品至5 mL，加入等体积的无水乙醇，振荡30 min，12 000 r/min离心15 min，过滤，上清液冻干，获得菲牛蛭粗提取样品，用于电泳分离。1.3.2Tricine-SDS-PAGE电泳胶的组成采用Tricine-SDS-PAGE分离菲牛蛭中的抗凝活性成分，由16.5%的分离胶、10%的夹层胶和4%浓缩胶共3层胶组成，先配制分离胶，聚合后配制夹层胶，最后配制浓缩胶，3种胶的制胶体积比为4∶1∶1。电泳胶的分离与组成见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.016.T001表1电泳胶的分离与组成试剂分离胶16.5%夹层胶10%浓缩胶4%49.5% T 3% C/mL00.4070.16049.5% T 6% C/mL1.5000凝胶缓冲液/mL1.500.6670.49650%甘油/mL0.9600ddH2O/mL0.540.9261.34410% PAGE胶凝固剂/µL40.0020.0020.000PAGE胶促凝剂/µL5.003.0003.0001.3.3电泳条件电泳时将电泳外槽加入阳极缓冲液，内槽加入阴极缓冲液，将样品（已经过Tricine专用上样缓冲液P1325处理）加入点样孔后，40 V电泳1 h，待指示前沿到达分离胶上沿时，将电压调至60 V电泳6 h，将胶置于固定液中固定1 h，使用1.5 g/L R250考马斯亮蓝染色液染色2~3 h，使用脱色液反复漂洗胶，直至电泳无背景颜色。1.4测定指标及方法1.4.1多肽分子量的测定采用凝胶图像系统对电泳条带进行图像数据采集，蛋白质对数分子量和迁移率成正比，按照标准蛋白质Marker建立分子量与迁移率方程，根据建立的方程计算多肽分子量。1.4.2多肽相对含量的测定采用电泳条带相对灰度值进行测定，对菲牛蛭粗提物进行电泳分离，采用凝胶图像系统对电泳条带进行图像数据采集，将数据传入电脑端；采用image lab5.2凝胶成像分析软件对获得的菲牛蛭中水蛭素条带的灰度值进行比较，根据相对灰度值的大小评价各多肽的相对含量。2结果与分析2.1水蛭素的电泳测定条件研究采用重组水蛭素对电泳条件进行分离效果判定，配制6个不同浓度的重组水蛭素上样液：0.025、0.125、0.250、0.375、0.500、1.000 g/L，按照1.3.2的电泳条件，对重组水蛭素进行电泳分离。不同添加浓度重组水蛭素电泳结果见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.016.F001图1不同添加浓度重组水蛭素电泳结果由图1可知，1~6个条带分别代表0.025、0.125、0.250、0.375、0.500、1.000 g/L浓度的重组水蛭素，随添加浓度增加，电泳条带颜色逐渐加深，以标准蛋白质分子量（蛋白标准M为3 300～31 000）为纵坐标y，蛋白质的迁移率为横坐标x，建立二者之间的回归方程为：即y=-31.080x+29.812。多肽分子量与迁移率呈良好的线性关系，相关系数R2=0.958 2。重组水蛭素的迁移率与分子量的回归方程见图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.016.F002图2重组水蛭素的迁移率与分子量的回归方程采用image lab 5.2凝胶成像分析软件计算图1中重组水蛭素条带的迁移率，该重组水蛭素的迁移率为0.46，由回归方程计算重组水蛭素的相对分子量为15.50 kDa。为比较多肽电泳条带相对灰度值于浓度之间的关系，分别以低浓度的水蛭素0.025 g/L为参比，采用image lab5.2凝胶成像分析软件中的相对定量方法计算其他5个重组水蛭素浓度的相对灰色值。重组水蛭素的浓度与条带相对灰度值的关系见图3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.016.F003图3重组水蛭素的浓度与条带相对灰度值的关系以此作为重组水蛭素的相对量，以重组水蛭素的上样浓度为横坐标x，重组水蛭素的相对数量为纵坐标y，建立二者之间的线性回归方程为：y=344.17x-5.159 8，回归方程的R2=0.993 8，二者间呈显著的线性相关关系，随着重组水蛭素浓度的增加，其相对含量呈直线增加趋势，进一步说明采用电泳条带相对灰色度值的准确性。2.2Tricine-SDS-PAGE电泳分离菲牛蛭中多肽效果比较2.2.1不同上样浓度对分离效果的影响按照1.3.1中获得的菲牛蛭粗提样品，分别配制9个不同上样浓度的样品。不同上样浓度见表2。不同上样浓度电泳图谱比较见图4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.016.T002表2不同上样浓度项目123456789上样量333.33166.67111.1183.3366.6755.5647.6241.6737.04μg10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.016.F004图4菲牛蛭中分离出的7种多肽的分子量由图4可知，1号电泳道上样量浓度过高，电泳条带均未分离开；随着上样量的减少，样品中多肽逐渐分离，当上样浓度≤66.67 μg时，所分离的电泳条带清晰，可较好地分离得到多肽。2.2.2Tricine-SDS-PAGE电泳分离的菲牛蛭多肽分子量比较以图4中第9号泳道所分离的多肽分别计算分离的多肽分子量，以标准蛋白质分子量的对数为纵坐标y，蛋白质的迁移率为横坐标x，建立二者之间的线性回归方程，电泳迁移率与分子量的回归方程见图5，y=-35.252x+31.587。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.016.F005图5电泳迁移率与分子量的回归方程分别计算所分离出小于31 kDa的各个多肽的分子量，共分离得到7个多肽；获得各条带的迁移率，按照建立的线性回归方程，分别计算出7个多肽的分子量和百分比。菲牛蛭分离多肽的分子量及占条带比例见表3。菲牛蛭中分离的7种多肽在总条带中的占比见图6。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.016.T003表3菲牛蛭分离多肽的分子量及占条带比例多肽编号迁移率分子量/kDa占总条带/%10.1031.0022.1620.1527.2835.4530.2122.5211.3240.2519.728.6450.3317.5115.9360.4415.014.9470.5012.871.5610.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.016.F006图6菲牛蛭中分离的7种多肽在总条带中的占比由表3可知，Tricine-SDS-PAGE分离菲牛蛭粗提物得到7个不同分子量的多肽，其分子量均在10 kDa以上，表明菲牛蛭中多肽分子量以10 kDa以上为主，第6和第7种多肽的分子量分别为15.01、12.87 kDa，与重组水蛭素的分子量接近。由图6中可知，7种多肽的总含量为100%，7种多肽的在总条带占比从高到低依次为：多肽2多肽1多肽5多肽3多肽4多肽6多肽7；多肽2的占比最高，占总条带中的35.45%，分子量27.28 kDa；第6种、第7种多肽分别占总条带中的4.94%和1.56%。3讨论Tricine-SDS-PAGE能够很好地分离分子量为1~10 kDa的蛋白及多肽，成为目前分离多肽的主要方法。在Tricine-SDS-PAGE中，Tricine可作为拖尾离子，以阳离子形式存在于体系中，使小分子多肽能够在浓缩胶中形成尽可能窄的条带，明显提高小分子多肽的分辨率[7]。王旭等[8]采用Tricine-SDS-PAGE分离分子量1 060~26 600 kDa范围内的多肽，通过对Tris-Tricine缓冲体系、4种不同的分离胶配比环节进行了改进，使小分子多肽的分离取得了较为理想的效果。郭长春等[9]采用Tricine-SDS-PAGE电泳分离北冬虫夏草提取液中的多肽，可粗略确定北冬虫夏草多肽提取液中含有分子量小于6.5 kDa的肽类物质，表明所制备的北冬虫夏草多肽提取液中含有小分子肽。卢舒凡等[10]采用Tricine-SDS-PAGE从广东菲牛蛭中分离得到一种电泳纯的活性多肽，多肽迁移率x与相对分子质量y的标准曲线y=-1.560 6x+4.861 6，R=0.995，菲牛蛭电泳条带菲牛蛭活性多肽的迁移率为0.37，由回归方程计算出相对分子质量约为19.2 kDa。吴少辉等[11]采用Tricine-SDS-PAGE分离美洲大蠊中小分子肽，通过对浓缩胶、夹层胶、分离胶等3种胶的不同高度配比进行了研究，结果表明，多肽混合物不同程度地存在聚集现象，对10 kDa左右的小分子多肽能够起较好的分离效果。邢芳芳等[12]通过对阴阳极缓冲液pH值及组成进行优化，选用银染法替代考马斯亮蓝染色法，优化Tricine-SDS-PAGE电泳条件，结果表明，该法优于常规的SDS-PAGE和现有的Tricine-SDS-PAGE方法，可有效分离3.1 kDa的重组牛乳铁蛋白肽，对212 kDa的大分子量蛋白也具有较好的分离效果。孙波等[13]采用Tricine-SDS-PAGE测定了酶解蛋清肽的分子量，蛋清肽的分子量集中在3 300~14 400 Da之间，与凝胶色谱法测定的分子量接近，两种方法平均相对误差在0.5%。本研究采用Tricine-SDS-PAGE分离菲牛蛭中的多肽，在电泳分离胶中加入甘油，获得了较好的分离效果，原因是向分离胶中加入甘油或尿素，增大了丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的交联度[14-15]，增加小分子多肽电泳分离效果。甘油还可降低凝胶缓冲液的极性，有助于分离小分子多肽。通过电泳纯重组水蛭素评价Tricine-SDS-PAGE的分离效果，根据标准蛋白相对迁移率与相对分子质量对数的曲线成强线性相关关系，可计算重组水蛭素的分子量在15.5 kDa；研究中共分离得到7个分子量均大于10 kDa的多肽，其中分子量为15.0和12.9 kDa的多肽接近黄爱民等[16]从菲牛蛭消化液中分离纯化得到的菲牛蛭素A和菲牛蛭素B。重组水蛭素溶液随着浓度的增加，重组水蛭素电泳条带的相对灰度值逐渐增加，不同浓度的重组水蛭素的相对灰度值与水蛭素浓度呈直线线性相关关系，R2为0.993 8，表明电泳条带相对灰度值可以评价不同浓度多肽的相对含量。未来可应用电泳条带相对灰度值评定不同样品菲牛蛭中多肽的相对含量，为药用动物活性多肽研究提供参考。4结论Tricine-SDS-PAGE能够较好地分离菲牛蛭中的多肽，菲牛蛭中小分子多肽对数分子量和迁移率呈直线回归关系；从菲牛蛭中分离得到7个分子量在10~31 kDa的多肽，分离后的电泳条带的相对灰度可作为评价多肽的相对含量。