油菜是我国的主要油料作物之一，种植面积居世界首位。油菜秸秆属于大宗的农业副产物资源，营养价值较好。除还田外，油菜秸秆饲料化利用是降低环境污染和有效利用的重要途径，具有广泛的应用前景[1]。油菜秸秆粉预处理可以使木质纤维素的天然高分子结构分解为易被微生物利用的结构[2]。废弃植物纤维资源可发酵生产蛋白饲料，实现农业废弃物的无害化、减量化和资源化[3]。在乡村地区，油菜秸秆大部分仍是焚烧处理或直接还田处理，油菜秸秆焚烧处理会污染大气环境，降低土地肥力，导致土地贫瘠；还田处理虽方便快捷，高效低耗，对土地有益，但其产生的经济效益较低。对油菜秸秆预处理后通过微生物发酵作用，其纤维素被分解产生的小分子葡萄糖又可作为碳源，能够减少油菜秸秆焚烧处理或直接还田导致的低效益问题，也是一种较为清洁处理油菜秸秆的方法。预处理是木质纤维素生物炼制中成本最高的一步操作，但通过改进研发技术，预处理成本具有很大的降低空间[4]。本试验预处理方法以常温、常压、低浓度、减少损耗、低污染为目的，从多方面考虑减少木质纤维素的间隙，与物理预处理、酸或有机溶剂等化学处理、微生物预处理、酶预处理[5]等方法相比，最终的油菜秸秆碱预处理方案更加高效、低廉。本试验经过预处理后接入黑曲霉，通过单因素和正交试验设计最优的产酶条件，能够在低成本中产生高效益，为油菜秸秆资源的利用与清洁化提供参考。1材料与方法1.1试剂材料1.1.1秸秆与菌株油菜秸秆购自自贡市某农户家里，粉碎，过筛，烘干，保存。黑曲霉菌株（活菌数3.25×107 CFU/g）为四川轻化工大学浓香型白酒资源微生物与大数据应用实验室保藏。1.1.2试剂与培养基柠檬酸缓冲液（0.05 mol/L，pH值4.8）、1%羧甲基纤维素钠溶液（CMC-Na）、DNS试剂。纤维素酶标准液[6]：称取0.200 0 g纤维素酶，溶于pH值4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，采用此缓冲液定容至100 mL，浓度为2 g/L。CMC-Na培养基（g/L）：2.5 g CMC-Na、0.75 g蛋白胨、0.25 g KH2PO4、0.125 g MgSO4·7H2O、250 mL H2O、5 g琼脂、pH值自然[7]。CMC-Na种子培养基（g/L）：1 g CMC-Na、0.3 g蛋白胨、0.1 g KH2PO4、0.05 g MgSO4·7H2O、0.05 g葡萄糖、100 mL H2O、pH值自然[7]。发酵产酶培养基：3 g油菜秸秆粉、2 g麸皮、液料比2 mL/g，0.2 g (NH4)2SO4，置于150 mL三角瓶灭菌，灭菌，接种10%种子液[7]。1.2测定指标及方法1.2.1菌株复苏将-4 ℃斜面保藏的黑曲霉菌株在CMC-Na平板培养基上划线，28 ℃培养48~72 h，连续划线培养2~3次，用于制备种子液。1.2.2种子液制备使用接种环取活化的菌株于CMC-Na种子培养基中，250 mL锥形瓶装液100 mL，在28 ℃、150 r/min恒温摇床中培养24 h，锥形瓶中放置一个磁力搅拌珠，接种后每隔4~6 h取出磁力搅拌珠搅拌1 h，放回培养箱。1.2.3油菜秸秆原料预处理参考白光剑等[8]预处理秸秆方法，称取20.00 g粉碎程度为20~40目的油菜秸秆粉，置于250 mL锥形瓶中，加入200 mL 1.1% NaOH（液料比为10 mL/g），密封，置于50 ℃环境中浸泡36 h，置于滤袋中洗至中性，烘干至恒重，称量。在单因素试验中，通过改变单因素，分别对浸泡时间、处理液浓度、液料比、处理液种类、粉碎程度进行单因素试验[8]。1.2.4秸秆原料预处理正交试验设计参照单因素试验结果，进行正交试验设计，选取浸泡温度（A）、浸泡时间（B）、NaOH浓度（C）为考察因素，测定秸秆比产糖量，采用3因素3水平进行L9（34）正交试验，得出最佳试验条件。秸秆原料预处理正交试验设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.017.T001表1秸秆原料预处理正交试验设计水平A/℃B/hC/%140241.0245301.1350361.21.2.5预处理原料固态产酶发酵培养基单因素优化试验配制固态产酶发酵培养基，准确称取烘干至恒重的预处理油菜秸秆粉和麸皮共5 g、硫酸铵0.2 g，液料比为2 mL/g，混匀，灭菌，冷却，接入黑曲霉，29 ℃恒温培养4 d。单因素试验因子选择为预处理油菜秸秆粉与麸皮的比例、氮源浓度、液料比、发酵温度、接种量、发酵时间，发酵结束测定固态发酵物中纤维素（CMC）酶活，确定最佳生产工艺条件。1.2.6固态发酵产酶培养基正交试验设计（见表2）参考单因素试验结果，进行正交试验，正交试验设计见表2。选取碳源配比（A）、硫酸铵浓度（B）、培养温度（C）、培养时间（D）为考察因素，测定CMC酶活，采用4因素3水平正交试验，得出最佳试验条件。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.017.T002表2固态发酵产酶培养基正交试验设计水平AB/%C/℃D/d15∶42.030427∶32.533533∶23.03661.2.7电镜分析取预处理的油菜秸秆粉，制片，喷金，采用电子扫描显微镜观察样品微观结构。1.2.8纤维素酶酶解反应在150 mL锥形瓶中加入预处理后的油菜秸秆0.500 g、5 mL纤维素标准酶液，加入柠檬酸缓冲溶液使酶解液至50 mL，将锥形瓶置于温度为50 ℃、80 r/min的摇床中，酶解反应72 h[9]。1.2.9粗酶液的制备及还原糖、酶活测定分析1.2.9.1油菜秸秆预处理粗酶液制备、还原糖测定分析取酶解液5 mL于离心管中，6 000 r/min离心5 min，取上清液0.5 mL，加入1.5 mL柠檬酸缓冲液，3 mL DNS溶液，置于沸水浴10 min，冷却，定容至25 mL（采用蒸馏水定容），540 nm分光光度计测OD值。计算秸秆产糖量、秸秆保留量、秸秆比产糖量和评估预处理效果[8]，预处理秸秆保留率在数值上等于预处理秸秆保留量[8]。预处理秸秆保留量=预处理后秸秆质量/预处理前秸秆质量(1)预处理秸秆产糖量=预处理秸秆酶解产还原糖量/预处理秸秆质量(2)秸秆比产糖量=预处理秸秆产糖量×预处理秸秆保留率(3)1.2.9.2预处理秸秆原料固态产酶发酵粗酶液制备、酶活测定取2.0 g固态发酵物加入20 mL蒸馏水，摇床中28 ℃、180 r/min振荡1 h，过滤，5 000 r/min离心10 min，上清液即为粗酶液[7]。羟甲基纤维素酶酶活测定：4根25 mL比色管，1根作空白对照；4根管中均加入1.5 mL 1% CMC溶液，3根试验管中加入0.5 mL粗酶液，空白管不加粗酶液，所有管50 ℃反应30 min，取出，加入1.5 mL DNS溶液，空白管加入0.5 mL粗酶液后与试验管沸水浴10 min，冷却至室温，定容至25 mL，540 nm测定吸光值，计算酶活[7]。酶活定义：在一定条件下，1 mL粗酶液每分钟水解底物产生1 μmol葡萄糖所需酶量定义为1个酶活单位（IU）[7]。IU=m×1 000×n180×t×0.5 (4)式中：1 000为葡萄糖单位mg换算为μg；n为稀释倍数；180为葡萄糖的摩尔质量（mg）；t为酶活反应时间（min）；0.5为换算成酶液1 mL。2结果与分析2.1电镜分析结果（见图1）油菜秸秆的结晶度在常见秸秆中较高，经过化学预处理可能较难达到其他秸秆的效果[10]。由图1可知，油菜秸秆内部的紧密结构出现断裂、坍塌，秸秆长管结构断裂，秸秆表面出现许多小孔，表明纤维素的结晶度和聚合度降低，可使纤维素酶更好地进入秸秆内部，提高酶的酶解效率。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.017.F001图1电镜分析结果2.2油菜秸秆单因素不同预处理结果（见图2~图6）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.017.F002图2浸泡时间对预处理的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.017.F003图3不同NaOH浓度对预处理的影响由图2~图4可知，秸秆比产糖量呈先增大后减小的趋势，分别在浸泡时间为48 h、NaOH浓度为1.2%、液料比为10 mL/g时秸秆比产糖量达到最大。浓度较高的NaOH浸泡能够破坏油菜秸秆中纤维素与半纤维素和木质素之间的紧密结构，降低木质纤维素原料的聚合度与结晶度，使木质纤维素原料发生溶胀作用，增加酶水解时酶对底物的可及度。长时间浸泡或浓度过高可能导致清洗时碱残留量较多，影响酶解反应，进而减少产糖，降低纤维素的利用率。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.017.F004图4不同液料比对预处理的影响酸处理对反应设备的抗腐蚀性较高，若使用廉价氢氧化钙在酶解液进行中和时会产生水不溶的石膏。预处理过程中会产生大量的抑制物，使后续微生物发酵受到抑制[11-12]。因此，本试验选用两种碱试剂作为油菜秸秆预处理液。由图5可知，KOH预处理后初始秸秆比产糖量比NaOH预处理低，表明碱性的强度会影响后续酶解反应的进行，因此，选择NaOH进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.017.F005图5不同处理液对预处理的影响由图6可知，秸秆比产糖量随着破坏程度增大而增大，40~60目油菜秸秆经过预处理可获得最高秸秆比产糖量，说明比表面积越大，NaOH越容易浸入油菜秸秆内部，能够更好地破坏纤维素与半纤维素和木质素之间的紧密结构，更好地进行酶解，对后续菌株发酵利用有利[13]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.017.F006图6不同粉碎程度对预处理的影响因此，最终确定单因素试验方案为：粉碎程度为40~60目油菜秸秆在液料比为10 mL/g、环境温度50 ℃、1.2%的NaOH浓度中浸泡时间48 h。2.3油菜秸秆预处理正交试验试验结果及分析（见表3、表4）根据上述油菜秸秆预处理单因素试验结果，以温度（A）、浸泡时间（B）、NaOH浓度（C）作为因素，进行3因素3水平正交试验。由表3可知，影响预处理后秸秆比产糖量的各因素大小关系为ACB，表明影响预处理秸秆比产糖量最大的是温度，最小的是浸泡时间，各因素最佳水平组合为A2B3C2。综合单因素试验结果，确定最佳预处理秸秆的工艺为油菜秸秆粉的粉碎程度为40~60目，液料比为10 mL/g，浸泡温度为45 ℃，浸泡时间36 h，NaOH浓度为1.1%。在此条件下，进行3次试验，在最优条件下，比产糖量可达0.181 1 g/g。由表4可知，各因素均对秸秆比产糖量具有显著影响（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.017.T003表3油菜秸秆粉预处理正交试验及结果分析项目A/℃B/hC/%保留量/(g/g)秸秆比产糖量/(g/g)产糖量/(g/g)140241.00.836 20.142 00.169 8240301.10.823 90.149 20.181 1340361.20.813 40.136 70.168 0445241.10.831 50.168 80.203 0545301.20.821 80.157 20.191 2645361.00.822 00.168 90.205 4750241.20.823 90.161 20.195 6850301.00.810 10.174 20.215 0950361.10.804 20.179 80.223 6k10.142 60.157 30.161 7k20.165 00.160 20.165 9k30.154 20.161 80.151 7R0.022 30.004 50.014 3因素主次ACB最佳方案A2B3C210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.017.T004表4油菜秸秆预处理方差分析表项目平方和自由度均方F值P值修正模型0.002a60.007 064.6900.000截距0.2310.2305 588 767.5680.000A0.00120.000 516 922.1350.000B3.073×10-521.536×10-5373.7330.003C0.00020.0003 898.0810.000误差8.222×10-824.110×10-8总计0.2329修正后总计0.0028注：1.R2=1.000，调整后R2=1.000。2.P0.05表示影响显著。Mcintosh等[14]发现，使用2% NaOH在121 ℃处理高粱秸秆60 min时，其酶解总糖率是空白对照的5.6倍；当使用2%的NaOH在60 ℃处理高粱秸秆90 min时，其酶解总糖量提高至空白对照的4.3倍。本研究中，在最优条件下，秸秆比产糖量达0.1811 g/g，运用最佳工艺预处理秸秆可将秸秆比产糖量的提高至不添加NaOH时（0.050 5 g/g）的36倍左右。2.4培养基优化结果2.4.1碳源比对黑曲霉发酵产酶的影响（见图7）预处理后油菜秸秆粉中仅有较少的微生物生长因子，而麸皮中含有一定的微生物生长因子，是一种常见的辅助碳源，添加麸皮能够提高产酶能力。安宝聚[15]在高产纤维素黑曲酶固态产酶发酵研究中发现，最佳麦麸与麦秆粉比例为3∶2~4∶1。周晨妍等[16]有关黑曲霉产纤维素酶固态发酵的试验中最优发酵条件为麸皮与玉米芯的比例6∶2。由图7可知，研究中最优麸皮与预处理的油菜秸秆粉的比例为3∶2~2∶3，表明经过预处理的油菜秸秆能提高菌株的利用率。但本试验主要利用较多油菜秸秆粉作为碳源，油菜秸秆粉与麸皮3∶2在存在较多油菜秸秆粉的情况下也具有较高酶活。因此，选择油菜秸秆粉与麸皮的比为3∶2作为碳源。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.017.F007图7碳源对产酶的影响2.4.2氮源浓度对黑曲霉发酵产酶的影响（见图8）由图8可知，氮源[(NH4)2SO4]添加量在2%时酶活达到最大，当超过2%时，可能是培养基碱性随着添加量逐渐增大，越不适合菌株生长，产酶能力也逐渐降低。在周晨妍等[16]黑曲霉菌株产纤维素酶的固态发酵条件优化中，以玉米芯为原料所需的氮源为4.0%。在经过预处理后油菜秸秆所需营养物质更易被吸收利用，其最适氮源添加量为2%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.017.F008图8氮源浓度对黑曲霉发酵产酶的影响2.4.3液料比对黑曲霉发酵产酶的影响（见图9）由图9可知，在液料比1.5 mL/g时，CMC酶活力最大，随着液料比增大，酶活逐渐降低，考虑水分过多会减少培养基间隙，导致其透气性不足，影响菌株生长，影响产酶能力。本试验为固体发酵，较低的液料比也符合其发酵特点。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.017.F009图9液料比对黑曲霉发酵产酶的影响因此，选择1.5 mL/g为最适液料比。在黑曲霉固态产酶发酵研究中[15-16]，液料比一般控制在1.5~2.0 mL/g。2.4.4发酵温度对黑曲霉产酶发酵的影响（见图10）由图10可知，温度可加速菌株体内反应进行，CMC酶活随培养温度逐渐升高，在培养温度33 ℃达到最大，超过此温度后，可能使菌株体内部分酶活下降，导致其产酶能力降低。因此，最适宜的培养温度为33 ℃。结合黑曲霉的生长特性及黑曲霉的相关研究[17]进行综合考虑，最适黑曲酶产纤维素酶的温度为28~30 ℃，此温度可作为参考，后续正交试验需对此进行进一步试验分析。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.017.F010图10发酵温度对黑曲霉产酶发酵的影响2.4.5接种量对黑曲霉发酵产酶的影响（见图11）霉菌具有大量孢子，其繁殖速度较快，即接入少量种子液也能大量繁殖，当接种量小于5%时，接种时吸取的孢子菌液不易控制，不利于试验操作，即不考虑接种量小于5%的情况。由图11可知，酶活在接种量为5%时达到最大，而后随着接种量的增大酶活力逐渐降低，可能是菌体生长消耗营养物质较多，不利于菌体保持活力。田杰[18]在黑曲霉发酵藤茶产酶研究中设置其接种量为5%。郭凯[19]在黑曲霉产酶特性研究中设置接种量为8%。霉菌繁殖较快，少量菌即可大量繁殖，因此确认最佳接种量为5%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.017.F011图11接种量对黑曲霉发酵产酶的影响2.4.6发酵时间对黑曲霉发酵产酶的影响（见图12）由图12可知，1~5 d内CMC酶活随着培养时间的增大而增大，超过5 d后，由于培养基内营养物质减少，菌体死亡，使酶活逐渐降低。所以最适宜培养时间为5 d。吴发远[20]在黑曲霉发酵生产纤维素酶条件的研究中最佳发酵时间为5 d。周晨妍等[16]在黑曲霉菌株产纤维素酶的固态发酵条件优化研究中，使用玉米芯为原料，最佳发酵时间为4 d。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.017.F012图12发酵时间对黑曲霉发酵产酶的影响2.5固态发酵产酶培养基正交试验结果（见表5）根据以上培养基单因子试验结果，以碳源配比、硫酸铵质量分数、培养温度、培养时间作为因子，进行4因素3水平正交试验。由表5可知，影响CMC酶活力的各因素大小关系为BCDA，说明影响CMC酶活力最大的是硫酸铵浓度，影响最小的是碳源的配比，各因素最佳水平组合为A1B2C1D2，确定最佳工艺为油菜秸秆粉比麸皮为5∶4，(NH4)2SO4浓度为2.5%，培养温度为30 ℃，培养时间为5 d。在此条件下，进行3次试验，得到其产纤维素酶活为7.923 IU。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.017.T005表5固态发酵产酶培养基正交试验结果项目AB/%C/℃D/dCMC酶活/IU15∶42.03047.29025∶42.53357.69735∶43.03667.03947∶32.03366.81057∶32.53647.40667∶33.03057.23673∶22.03657.20083∶22.53067.78293∶23.03346.682k17.3427.1007.4367.126k27.1507.6287.0637.378k37.2216.9867.2157.210R0.1920.6430.3730.252因素主次BCDA最佳方案A1B2C1D2由表5可知，碳源的配比对酶活力影响在其他几个因素中影响最小，若考虑油菜秸秆的资源化应用，也可从表中选择其他碳源的配比。李豪[7]在油菜秸秆产酶研究中，运用紫外突变高产纤维素酶菌株将黑曲霉产纤维素酶活提高至8.17 IU；本试验运用普通黑曲霉菌株并将其产纤维素酶活提高至7.923 IU，两者仅差0.3%，且在优化前培养基产纤维素酶活为5.657 IU，说明本研究中油菜秸秆预处理及产酶优化研究相较其他研究能够显著降低其工艺需求。3讨论油菜秸秆比其他秸秆结构更为紧密，所以在油菜秸秆预处理方面，更多的是利用高温、高压蒸汽进行蒸汽爆破[21]，此方法涉及的工艺要求较高。本研究中，使用碱预处理可以降低费用，运用最佳工艺预处理秸秆可将秸秆比产糖量的提高至未添加NaOH时（0.050 5 g/g）的36倍左右。研究结果用秸秆比产糖量作为评估预处理标准，可以更加直观为油菜秸秆预处理提供另一种表示预处理效果的方法，目前最为有效的就是用氢氧化钠破坏木质素结构，增强半纤维素的可及性。本试验中，普通黑曲霉菌株固态产酶发酵优化后CMC酶活可达7.923 IU。李豪[7]使用紫外突变高产纤维素酶黑曲霉菌株最高酶活仅达8.17 IU/g，两者仅差0.3%，表明本研究中油菜秸秆预处理及产酶优化研究能够显著降低油菜秸秆预处理工艺需求。固态发酵产纤维素酶的底物多是农业或工业废弃物，如农作物秸秆、甘蔗渣等，试验以资源丰富的油菜秸秆为原料，能够减少资源浪费。刘佳[22]对比了毛壳菌M6液态发酵和固态发酵产酶的差异，固态发酵产酶是液态的2.25倍，固态发酵产酶明显优于液态发酵。Herculano等[23]利用棕榈仁饼做底物，使用黑曲霉固态发酵纤维素酶为244.53 U/g。本研究使用油菜秸秆粉进行固态发酵，黑曲霉的生长旺盛、产酶能力较强。本研究可作为油菜秸秆资源快速利用、资源化、清洁化提供参考，油菜秸秆发酵产纤维素技术可为实际生产提供更丰富的碳源来源。在饲料化技术研究中，原料主要以玉米、高粱为主，本研究可为油菜秸秆饲料化提供参考。由于本试验只研究了化学预处理油菜秸秆产糖效果以及发酵粗酶酶活，未比较物理、化学等预处理方法之间的差异性、未对预处理试验过程中产生的废水进行处理、未对发酵产生纤维素酶进行分离纯化，后续研究应进一步研究菌株所产生纤维素酶的分离纯化，以期获得纯度较高的酶，为菌株应用于工业化生产提供参考，对生产过程产生的废水进行净化处理。4结论在油菜秸秆粉的预处理工艺试验中，确定油菜秸秆预处理的最佳工艺条件为以40~60目的油菜秸秆粉为原料，以10 mL/g的液料比，1.1%的NaOH在45 ℃浸泡36 h。此时获得的秸秆比产糖量最高为0.181 1 g/g。在用预处理后的油菜秸秆粉进行产酶发酵优化的试验中，确定最佳固态产酶发酵工艺为油菜秸秆粉与麸皮比为5∶4、(NH4)2SO4浓度为2.5%、液料比为1.5 mL/g、接种量为5%、培养温度为30 ℃、培养时间为5 d，测得CMC酶活可达7.923 IU。