茶皂素（tea saponin）又名茶皂苷、皂角苷及皂苷，具有皂苷的通性，基本结构由三萜皂苷、结构糖、结构酸组成，水溶液呈茶褐色，无不溶物[1]。茶皂素不仅是一种天然的非离子表面活性剂，还是一种功能广泛的生物活性物质。茶皂素具有无毒害、无残留、不产生抗药性等特点，具有多种药用价值和营养功能，能够溶血、杀菌、抗病毒、抗肿瘤、抗应激、促生长、抗氧化等[2-4]。严淑红等[5]研究表明，在饲粮中添加茶皂素可以改变奶牛瘤胃发酵模式和奶牛瘤胃微生物区系。李玉等[6]研究表明，茶皂素能够促进小肠各段发育，提高营养物质的消化和吸收。吕海鹏[7]研究表明，茶皂素对猪圆环病毒2型具有抑制作用。茶皂素可以作为天然的饲粮添加剂，在动物生产中被广泛应用。茶皂素的提取方法以水提和醇提为主。水提法存在能耗大、纯度低、分离难等缺点[8]。醇提法能耗低、提取率高、提取的产品纯度优，是提取茶皂素的常规方法。醇提法常用的溶剂有甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇等。由于溶剂的毒性、环保及成本等因素的制约，目前提取工艺多采用乙醇水溶液作为提取溶剂[9-10]。茶酒糟是茶叶发酵后的副产物，其中仍含有大量的茶皂素。广西柳州市三江县是广西重要的茶叶生产基地，茶叶的种植、深加工以及茶生态生活是当地的重要特色产业，是当地农民获得经济收入的重要途径[11]。广西三江吉龙农业科技开发有限公司是国内知名的茶酒生产企业，年产茶酒超过1 000 t，其间产生大量的茶酒糟。但由于提取技术匮乏，茶酒糟多用作肥料甚至直接废弃，降低了茶酒糟的利用价值。本研究以茶酒发酵后的副产物茶酒糟为原料，采用乙醇溶液浸提的方法提取茶皂素，探究乙醇浸提提取茶皂素的最佳工艺条件，对提取的茶皂素进行抑菌试验，为其作为饲粮添加剂的开发利用提供参考。1材料与方法1.1试验材料茶酒糟由广西柳州市三江县吉龙农业科技有限公司提供。供试菌种为表皮葡萄球菌、变形杆菌、沙门氏菌，均为本学院微生物教研室保藏菌种。1.2主要试剂茶皂素标准品（HPLC≥98%，成都埃法生物科技有限公司）、无水乙醇（陇西科学股份有限公司）、活性炭（AR，成都市新都区木兰镇工业开发区）、香草醛（AR，国药集团化学试剂有限公司）、浓硫酸（AR，成都市科隆化学品有限公司）。1.3主要仪器800T型粉碎机（永康市红太阳机电有限公司）、THZ-82型水浴恒温振荡器（杭州旌斐仪器科技有限公司）、GZX-GF101-3BS型电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械有限公司）、FA2004B型电子天平（上海越平科学仪器有限公司）、UV-2006紫外可见分光光度计、IRTracer-100傅里叶变换红外光谱仪（岛津企业管理（中国）有限公司）。1.4试验方法1.4.1原料预处理将茶酒糟均匀摊开于托盘中，75 ℃电热恒温鼓风干燥箱烘干，粉碎，过40目筛，密封袋保存。1.4.2茶皂素的定量分析皂苷显色法是茶皂素常用的定量分析方法，特点是香草醛-浓硫酸能够与茶皂素反应形成特征的红色。原理：皂苷是一类含有糖苷键的四环或五环三萜的化合物，C3和C12上的羟基可与香草醛的醛基发生反应形成缩醛，成为新的共轭体系而显色[12]。1.4.2.1标准曲线的绘制参照张文婷[13]方法并略做修改，使用体积分数为80%乙醇溶液将0.020 0 g茶皂素标准品定容至25 mL容量瓶中，配制为茶皂素标准溶液。取6支25 mL具塞比色管编号，依次移取茶皂素标准溶液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL于比色管中，分别加入1.00 mL 80%乙醇溶液，摇匀；分别加入0.50 mL 8%香草醛溶液，于冷水浴中分别加入4.00 mL 77%硫酸溶液，摇匀，60 ℃恒温水浴锅中加热15 min，冷水浴中冷却10 min，取出，室温放置至恒温。以1号试管为空白，550 nm吸收波长处测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，线性回归方程为y=0.970 6x-0.046 7（R2=0.992 3），表明线性关系良好，可用于茶皂素含量的测定。1.4.2.2样品含量精密吸取0.50 mL的茶皂素浸提液，稀释50倍。移取1.00 mL稀释液至比色管中，加入1.00 mL体积分数为80%乙醇溶液，0.50 mL 8%香草醛溶液，77%硫酸溶液4.00 mL，摇匀，60 ℃恒温水浴锅中加热15 min，冷水浴中冷却10 min，室温放置至恒温，550 nm吸收波长处测定吸光度，做3次平行试验。1.4.3茶皂素的提取过程准确称取2.000 0 g茶酒糟于250 mL具塞锥形瓶中，加入30.00 mL一定体积分数的乙醇溶液，混匀后于一定的温度的水浴恒温振荡器中浸提一定的时间，提取结束，除去滤渣，加入1 g活性炭于滤液中搅拌3 min，过滤，测定茶皂素含量，计算茶皂素提取率（X）。X=(C×V×T)/m (1)式中：C为茶皂素的浓度（g/L）、V为茶皂素提取液的体积（mL）、T为稀释倍数；m为茶酒糟质量（g）。1.4.3.1单因素试验采用控制变量法，选取影响茶皂素提取率的因素进行单因素试验，以茶皂素提取率为试验指标，在不同的提取温度、提取时间、液料比、乙醇体积分数进行单因素试验。（1）提取温度的确定。精确称取6份2.000 0 g茶酒糟，置于250 mL具塞锥形瓶中，设置液料比为15 mL/g，乙醇浓度70%，混匀，分别于50、55、60、65、70、75 ℃的水浴恒温振荡器中浸提1 h，测定浸提液中茶皂素含量。（2）提取时间的确定。精确称取6份2.000 0 g茶酒糟，置于250 mL具塞锥形瓶中，设置液料比为15 g/mL，乙醇体积分数为70%，混匀，于65 ℃水浴恒温振荡器中分别浸提30、60、90、120、150 min，测定浸提液中茶皂素含量。（3）液料比的确定。设置液料比分别为5、10、15、20、25、30 mL/g，量取30 mL 70%乙醇溶液，按照液料比分别精确称取一定量的茶酒糟于250 mL具塞锥形瓶中，混匀，于65 ℃水浴恒温振荡器中浸提1 h，测定浸提液中茶皂素含量。（4）乙醇体积分数的确定。准确称取6份2.000 0 g茶酒糟，置于250 mL具塞锥形瓶中，设置液料比为15 mL/g，分别加入60%、65%、70%、75%、80%、85%的乙醇溶液，混匀，于65 ℃水浴恒温振荡器中浸提1 h，测定浸提液中茶皂素含量。1.4.3.2正交试验设计根据单因素试验结果，设计L16（45）正交试验，考察温度（A）、乙醇体积分数（B）、液料比（C）、提取时间（D）对茶皂素提取率的综合作用。正交试验因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.019.T001表1正交试验因素水平水平A/℃B/%C/(mL/g)D/min16065153026570206037075259047580301201.4.4红外光谱取适量茶皂素标准品和提取得到的茶皂素样品，与溴化钾(Kbr）混匀研磨，制得溴化钾压片。在4 000~400 cm-1波数范围下扫描，得到红外光谱图[14]。1.4.5抑菌试验选取表皮葡萄球菌、变形杆菌、沙门氏菌3种菌种作为试验材料，采用牛津杯法测试茶皂素对3种菌种机理活性的影响[15-16]。茶皂素浸提液经浓缩，烘干，准确称取一定量的茶皂素粗提物，使用50 mL的无菌水溶解，分别配制为质量分数为10、20、30、40、50、60 g/L的茶皂素溶液，紫外灯下灭菌30 min。将表皮葡萄球菌、变形杆菌、沙门氏菌分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，37 ℃下活化24 h，分别使用接种环从斜面上挑菌至100 mL无菌水中振荡，制成均匀的菌悬液，经过适度稀释使菌悬液的菌体量约为106个/mL。使用移液枪分别吸取150 μL菌悬液于培养基表面涂布均匀，将牛津杯放置在培养基表面，每个培养皿放3个牛津杯，分别在牛津杯中加入200 μL不同浓度茶皂素溶液，4 ℃放置4 h，使其充分扩散，于37 ℃的培养箱中静置培养24 h，测量各抑菌圈直径。每个试验菌种，每个茶皂素浓度做3次平行试验，结果取平均值。2结果与分析2.1单因素试验2.1.1乙醇体积分数对茶皂素提取率的影响（见图1）由图1可知，在乙醇体积分数为70%时，茶皂素的提取率最大，原因可能是体积分数为70%的乙醇的极性与茶皂素的极性相似，两者互溶度大，茶皂素更易溶出，而乙醇体积分数过高，茶酒糟中的一些蛋白质以及可溶性的糖类物质等易发生凝聚，从而影响茶皂素的提取率。因此，选取70%乙醇体积分数为最佳体积分数。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.019.F001图1乙醇体积分数对茶皂素提取率的影响2.1.2液料比对茶皂素提取率的影响（见图2）由图2可知，随着液料比的增加，茶皂素的提取率也随之提高，当液料比高于25 mL/g时，茶皂素的提取率略有下降。液料比为5 mL/g时，提取率极低的原因可能是溶质和溶剂的比例较小时，茶酒糟浸提液存在饱和现象，导致茶皂素难以溶解出；随着液料比升高，茶皂素与溶剂的接触概率增大，对茶皂素的溶出有利。当液料比达30 mL/g时，茶酒糟中其他醇溶性的物质被溶解，从而阻碍茶皂素溶出。因此，选取25 mL/g为提取茶皂素的最佳液料比。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.019.F002图2料液比对茶皂素提取率的影响2.1.3提取时间对茶皂素提取率的影响（见图3）由图3可知，30~90 min内，茶皂素的提取率随提取时间的增加而提高，可能是由于随着提取时间延长，茶皂素能够有足够的时间与浸提液充分接触，使茶皂素不断地在溶剂中溶解，提取率不断提高。提取时间大于90 min后，随着提取时间的增加，茶皂素的提取率呈下降趋势，可能是茶皂素经过长时间受热而分解，由于长时间加热，茶酒糟中的蛋白质和单宁等物质的溶出也会阻碍茶皂素的溶出。因此，选取90 min为茶皂素提取的最佳时间。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.019.F003图3提取时间对茶皂素提取率的影响2.1.4提取温度对茶皂素提取率的影响（见图4）由图4可知，随着提取温度升高，茶皂素的提取率逐渐增大，原因可能是温度升高，茶酒糟浸提液中分子的热运动速度加快，茶皂素分子从茶酒糟中向浸提液扩散的速度增快，使茶皂素的提取率增大。由于乙醇的沸点为78 ℃，温度过高会导致乙醇挥发，影响液料比的准确性。因此，选取75 ℃为茶皂素提取的最佳温度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.019.F004图4提取温度对茶皂素提取率的影响2.2茶皂素提取正交试验优化结果（见表2、表3）由表2可知，各因素影响茶皂素提取率的主次顺序为CDBA，即液料比提取时间乙醇体积分数提取温度。较优参数组合为A1B3C4D3，即从茶酒糟中提取茶皂素的最佳条件为温度60 ℃，乙醇体积分数75%，液料比30 mL/g，提取时间90 min。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.019.T002表2正交试验优化结果与极差分析项目ABCDE（空列）提取率/%1111116.252122228.8531333313.0241444415.895212349.546221436.1072341216.5982432111.1593134210.56103243116.9811331246.4312342139.81134142313.81144231411.25154324110.0916441326.93k111.0010.046.4310.9811.12k210.8410.809.5710.0610.73k310.9411.5311.4911.6210.69k410.5210.9515.8210.6610.78R0.491.499.391.560.43主次顺序CDBA最优组合A1B3C4D3由表3可知，茶酒糟中提取茶皂素的过程中，液料比对茶皂素提取影响极显著（P0.01），乙醇体积分数和提取时间影响显著（P0.05），提取温度影响不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.019.T003表3正交试验方差分析项目平方和自由度均方F值P值显著性合计195.7615提取温度0.5630.191.220.44乙醇体积分数4.5431.519.880.05*液料比185.15361.72403.300.00**提取时间5.0631.6911.030.04*误差0.4630.15注：“*”表示影响显著（P0.05），“**”表示影响极显著（P0.01）。2.3茶皂素提取工艺的验证试验结果（见表4）按照茶皂素提取的最佳工艺条件，进行3次平行试验，分别准确称取1.000 0 g茶酒糟，在温度60 ℃、乙醇体积分数75%、液料比30 mL/g、提取时间90 min的条件下提取茶皂素，测定茶皂素的含量，计算提取率，验证提取茶皂素试验条件的稳定性。由表4可知，3次平行试验的结果稳定，提取率最高达17.44%，表明正交试验得到的最佳提取条件可取。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.019.T004表4茶皂素提取工艺的验证试验结果序号温度/℃乙醇体积分数/%液料比/(mL/g)时间/min提取率/%16075309017.4126075309017.3636075309017.442.4红外光谱测定结果（见图5、图6）由图5、图6可知，两个红外谱图分别在3 425、3 443 cm-1处有吸收峰，为羟基伸缩振动吸收峰；3 074、3 065 cm-1为饱和C—H的伸缩振动；在2 500~1 900 cm-1范围无明显的吸收峰，表明无三键和累积双键出现；1 688、1 691 cm-1为羰基伸缩振动吸收峰；1 085、1 078 cm-1为C—O伸缩振动吸收峰；707、702 cm-1为C—H面外弯曲振动吸收峰。因此，该物质中含有羟基、甲基和羰基等，与茶皂素的主要官能团基本一致，且样品和茶皂素标准品图谱数据基本相同。因此，本试验得到的样品是茶皂素。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.019.F005图5茶皂素标准品红外光谱10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.019.F006图6茶皂素样品红外光谱2.5抑菌试验结果（见表5）由表5可知，茶皂素对不同菌种的抑菌效果表现均不相同，抑制效果与浓度有密切关系，抑菌圈直径随茶皂素浓度变化呈随浓度升高而增大的规律。因此，茶皂素溶液对表皮葡萄球菌具有明显的抑制作用，对变形杆菌的抑菌效果较弱，对沙门氏菌无抑制作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.019.T005表5抑菌试验结果茶皂素浓度/(g/L)抑菌圈直径/mm表皮葡萄球菌变形杆菌沙门氏菌10000200003060040105050138060161203结论本研究采用乙醇浸提法从茶酒糟中提取茶皂素，对提取温度、乙醇体积分数、液料比、提取时间等4个因素进行单因素试验并设计正交试验进行优化，得到提取茶皂素的最佳工艺条件为：浸提温度60 ℃、乙醇体积分数75%、液料比30 mL/g、提取时间90 min。在此条件下进行3次平行验证试验，结果显示，茶皂素的最高提取率为17.44%，最低提取率为17.36%，二者相差较小，表明提取茶皂素的最优工艺条件稳定可靠、合理可行。试验得到样品和茶皂素标准品图谱数据基本相同，表明本试验得到的样品是茶皂素。抑菌试验表明，茶皂素溶液对表皮葡萄球菌具有明显的抑制作用，对变形杆菌的抑菌效果较弱，对沙门氏菌无抑制作用。生产茶酒的副产物茶酒糟仍含有丰富的茶皂素。本试验可以为促进茶酒生产的副产物茶酒糟资源的有效开发和利用提供一定参考，为进一步研发适合动物生长需要的茶皂素类饲粮添加剂产品的原料提供更多选择。