植物性饲料能够为动物提供丰富的蛋白质、脂肪、粗纤维等营养物质，促进动物生长发育与繁殖[1]。玉米蛋白粉是一种植物性饲料[2]，其蛋白质含量约60%，粗纤维含量低、易消化，代谢能高于或等于玉米，含有丰富的色素，常作为畜禽的蛋白质饲料原料[3]。玉米蛋白粉在市场上经常以蛋白计价，价格较贵，但存在混入尿素等含氮的有机物，以次充好的现象。掺假玉米蛋白粉成为饲料原料将会对养殖业造成损失[4]。归一化法是一种算法，一般粗略考察供试品的纯度。本文采用归一化法的思想，在一定分析条件下，样品经过直接溶解、过滤等操作后，计算总氮含量百分比和直接滴定体积的关系，求出试样测得总氮含量值是否落在控制区间内（一般置信水平为95%），若超出控制区间说明试样异常，其中总氮主要以氨基酸和酰胺的形式存在。标准样品中酰胺直接碱化蒸馏使氨游离，采用硼酸吸收后以盐酸标准溶液滴定，得到直接蒸馏法滴定体积。利用总氮含量与酰胺固定比例关系，建立总氮含量与直接蒸馏法消耗体积的回归方程。求取待测样品的总氮含量及直接蒸馏法消耗体积后，与回归方程比较，能够鉴定玉米蛋白粉是否掺假，为鉴别玉米蛋白粉掺假提供适宜的检测方法。1材料与方法1.1试验仪器感量0.000 1 g分析天平（梅特勒托利多集团）、250 mL凯氏烧瓶、消煮炉或电炉、250 mL消煮管、凯氏蒸馏装置、全自动凯氏定氮仪（瑞士步琦有限公司）。1.2试验材料试验所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的三级水。试剂若无特别说明按照GB/T 603要求配制。硼酸、氢氧化钠、硫酸，凯氏定氮催化剂片、蛋白质含量40%~70%的玉米蛋白粉标准样、硼酸吸收液（20 g硼酸加水溶解，稀释至1 000 mL）、氢氧化钠溶液（40 g氢氧化钠加水溶解，冷却至室温稀释至100 mL）、0.1 mol/L盐酸标准滴定溶液、甲基红乙醇溶液（0.1 g甲基红加乙醇溶解，稀释至100 mL）、溴甲酚绿乙醇溶液（称取0.5 g溴甲酚绿加乙醇溶解，稀释至100 mL）、混合指示剂溶液（将甲基红乙醇溶液和溴甲酚绿乙醇溶液等体积混合）。1.3测定指标及方法1.3.1样品制备抽取玉米蛋白粉样品8份，采用四分法缩减取样，粉碎后通过0.42 mm试验筛，混匀，装入密闭容器。1.3.2掺假鉴别回归方程的建立1.3.2.1总氮含量称取充分混匀的玉米蛋白粉标准样0.1~0.4 g（相当于30~40 mg氮，精确至0.001 g）至消化管中，加入6.4 g混合催化剂及15 mL硫酸消化。当消化管中的液体呈绿色透明状，停止加热。总氮含量（Yi）按照GB/T 6432—2018方法测定。每个试样取两个平行样测定，以其平均值为测定结果。1.3.2.2直接蒸馏法消耗标准溶液滴定体积参考GB/T 6432—2018方法，称取1.0 g（精确至0.001 g）试样于蒸馏管内，加入30 mL硫酸钠溶液，充分混合置于蒸馏管，测定氨含量，得到直接蒸馏法消耗标准溶液滴定体积（Xi）。1.3.2.3回归方程将测得结果利用Yi和Xi的相关性建立回归方程，计算系数a、b。Y=aX+b (1)式中：Y为总氮含量，单位为%；X为直接蒸馏法滴定体积，单位为mL。1.3.2.4计算剩余标准差将上述得到的8组Yi和Xi带入回归方程得到的Y值，计算剩余标准差（S）。S=∑i=18Yi-Y62 (2)式中：Yi为1.3.2.1中得到的总氮含量；Y为1.3.2.2中得到的直接蒸馏法消耗标准溶液滴定体积Xi代入公式（1）得到的值。1.3.3样品测定将待测试样按1.3.2.1、1.3.2.2方法测定，得到总氮含量（Y样）与直接蒸馏法消耗标准溶液滴定体积（X样）。1.4数据统计与分析将试样测得Y样值代入公式（3），若Y样值的控制区间内（一般置信水平为95%），说明试样正常；若超出控制区间说明试样异常，参考DB22/T 294-2020方法，利用公式（3）计算鉴别结果。a(X样-1.96S)+b＜Y样＜(X样+1.96S)+b (3)式中：a、b为式（1）中的系数；X样为试样得到的直接蒸馏法消耗标准溶液滴定体积。采用Excel统计数据。2结果与分析取8份样品，建立回归方程，玉米蛋白粉标准样品建立的回归方程及相关系数，见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.027.T001表1玉米蛋白粉标准样品建立的回归方程及相关系数项目12345678回归方程相关系数(R)1直接蒸馏法2.2822.3182.6172.7073.2043.5093.7054.240y=17.686 0x+0.801 80.999 5凯氏定氮法40.97541.59847.63348.69557.13262.98666.50775.6492直接蒸馏法2.2422.5233.0683.6273.8193.8964.3444.329y=17.860 0x+0.620 90.999 2凯氏定氮法40.61845.92455.17465.47168.33470.55677.72478.5283直接蒸馏法2.2532.3622.6482.8053.183.4693.7774.194y=18.188 0x+0.010 40.996 2凯氏定氮法41.27542.89848.83849.68758.15863.68967.60876.8434直接蒸馏法2.2562.5793.1283.7073.8573.9764.4244.529y=17.225 0x+2.113 10.997 6凯氏定氮法40.65346.12256.07766.48469.30471.54977.82979.0285直接蒸馏法2.2812.3162.6242.7153.2783.5273.7354.256y=17.425 0x+1.321 80.998 2凯氏定氮法40.95341.56447.62348.89457.23763.08166.51475.6636直接蒸馏法2.2372.5563.1283.6433.8263.9164.2494.310y=18.314 0x-0.927 00.998 1凯氏定氮法40.72846.02155.27565.57068.53770.85377.62378.4397直接蒸馏法2.2832.3262.5972.6993.2313.5123.7134.252y=17.561 0x+1.139 40.998 7凯氏定氮法40.89941.61247.59648.70557.33362.97466.60375.6188直接蒸馏法2.2452.5483.1283.6673.8353.9364.4424.521y=17.197 1x+2.121 80.996 4凯氏定氮法40.63245.82355.19265.46868.34971.64677.78179.128以1号样品为例，1号样品中玉米蛋白粉标准样建立的回归方程及相关系数见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.027.F001图11号样中玉米蛋白粉标准样建立的回归方程及相关系数根据回归方程按照式（2）计算剩余标准差S=0.304，按照1.3.3中方法测定样品，得到直接滴定体积X样=2.496 mL和总氮含量Y样=45.963%。根据鉴别公式（3），Y样=45.963%落在置信区间内，认为有95%的置信度证明该玉米蛋白粉未掺假。3讨论玉米蛋白粉的掺假物主要包括非蛋白氮聚合物、羽毛粉等。目前有效识别各种掺假的玉米蛋白粉的物理检测法主要包括视觉、嗅觉等方式。优质的玉米蛋白粉状态分为颗粒状和粉状，颜色呈淡黄色、金黄色或橘黄色，不透明，无霉变，有烤玉米或玉米发酵的特殊气味。加水检测，将少许玉米蛋白粉置于样品5倍的水中搅拌后静置，掺假的玉米蛋白粉浮在水面，沉淀很慢；或显微镜下观察，优质的玉米蛋白粉是黄白色细颗粒，颜色质地均匀，无异常物体出现[5]。化学法检测饲料中粗蛋白一般利用凯氏定氮法。在催化剂作用下，采用硫酸破坏有机物，使含氮物转化为硫酸铵，加入强碱进行蒸馏使氨逸出；采用硼酸吸收，以酸滴定，测出氮含量，计算粗蛋白含量[6]。研究消化温度对消化完全程度的影响，催化剂的用量、蒸馏时间、盐酸浓度等对粗蛋白测定试验结果的影响[7]，探索优化条件[8]，使检测结果更加准确，但检测方法较复杂。而本文是利用归一化法测量植物性饲料中蛋白质，具有简便、准确、不需要对消化液移液和标定[9]以及操作条件变化时对结果影响小等优点，计算结果是植物性饲料中总氮含量所占的百分比。取待测样品在碱性条件下蒸馏，将以酰胺形式结合的氮以氨的形式释放并被吸收滴定，利用其与总氮的相关性进行回归分析，进行粗蛋白的快速测定，通过对回归线的控制进行掺假鉴别与测定。此方法可不经消化，利用直接蒸馏法，使蒸馏、吸收、滴定同步完成，测定样品耗时少。根据玉米蛋白粉中以酞胺形式结合氮与滴定剂消耗体积相关性作一元线性回归处理，实现了对掺假玉米蛋白粉的简便、快速、有效和准确鉴别[10]。为更安全、更准确地完成试验，在氨的蒸馏时要注意检查蒸馏装置的密闭性[11]；应控制反应容器里的溶液总体积；调整合适的火力，火力太大，蒸汽量大，易将反应液喷进冷凝管中；火力太小，蒸馏速度慢，且易发生倒流，可安装蒸汽发生器的安全管并加入适量玻璃珠以防止暴沸[12]。还可利用该方法探索建立相应的数学模型，分析植物源性饲料中粗蛋白测定的结果不确定度来源，包括盐酸标准溶液浓度的标准不确定度、样品称量过程的标准不确定度及凯氏定氮仪引入的不确定度等，对各个不确定度分量分别进行评定，计算饲料中粗蛋白合成不确定度和扩展不确定度[13]。分析测定过程中，随机效应和系统效应导致的不确定度，探索不确定度可降低的因素，对各方面条件进行优化改进，提高结果准确度[14]。植物性饲料在动物生产中具有很高的饲用价值。研究表明，玉米蛋白粉代替45%的鱼粉不影响大黄鱼幼鱼生长和存活[15]。因此，合理地开发利用植物性饲料，可节约饲料资源，降低环境污染。加大对玉米蛋白粉的综合利用开发，能够促进玉米产业发展，提升玉米副产物价值，产生较大的经济效益。玉米蛋白粉的粗蛋白测定可利用本文所建立的方法，同时也可结合物理方法鉴定是否掺假。4结论本研究对市售的30个植物性饲料样品和3个质控样品进行检测，检测效果均较好，因此，试验为其他植物性饲料粗蛋白的测定提供了参考。