近年来，首次在猪用复合预混饲粮中检出了新型非法添加物“米诺地尔”，含量为30 mg/kg[1]。米诺地尔，化学名为6-(1-哌啶基)-2,4-嘧啶二胺-3-氧化物，可作为治疗高血压的血管扩张药[2-3]。米诺地尔是钾离子通道开启剂，可以增强钾离子通透性，也可作为潜在的治疗紫杉醇诱导的神经病变的神经保护药物[4]。长期使用米诺地尔可能造成毛发增多，可以外用治疗男性脱发[5-6]。但持续高剂量使用米诺地尔会造成一系列不良反应，如刺激性皮炎、眩晕、胸痛、血压变化等[7-8]。依据我国2015年版《化妆品卫生规范》，米诺地尔及其盐属于化妆品禁用组分，其检测方法大多是针对其生发机理的研究[9-10]或其在化妆品[11-14]、血浆[15]、尿液[16]中的检测。在畜牧养殖中，诺地尔及其盐并不在《中国兽药典》（2020版）以及《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》（GB 31650—2019）等存在，属于饲料中的新型非法添加物质。目前，尚无有关米诺地尔在动物生产中的研究，仅有专利表明该类化合物可增加动物增重速度、提高瘦肉率，促进家畜的生长[17]，但其在饲料中的非法添加所造成的食品质量及人身安全的风险未知。因此，针对已在饲料质量安全风险监测过程中，发现非法添加米诺地尔这一风险情况，亟须建立相关检测方法。本试验建立了猪用添加剂预混合饲粮中米诺地尔经有机相提取及固相萃取净化的前处理方法，应用超高效液相色谱仪快速测定其含量，为监测饲料中米诺地尔含量提供参考。1材料与方法1.1仪器与试剂主要仪器：Acquity UPLC型超高效液相色谱仪（Waters公司）；Empower 3数据处理系统（Waters公司）；MCX混合型强阳离子固相萃取柱（Oasis 60 mg/3 mL，Waters公司）；N-EVAP 型水浴控温氮吹仪（上海安谱实验科技股份有限公司）。主要试剂：米诺地尔标准品（CAS：38304-91-5，纯度99.7%，BePure公司）、乙腈（色谱纯，Merck公司）、甲酸（色谱纯，Tedia公司）、甲醇（色谱纯，Merck公司）、氨水（分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司）、超纯水（Milli-Q自制）。1.2标准溶液配制称取米诺地尔标准品10 mg（精确至0.01 mg）于10 mL棕色容量瓶中，甲醇溶解定容配制1 g/L标准储备溶液。准确移取标准储备溶液1 mL于10 mL棕色容量瓶中，0.1%甲酸溶液定容配制100 mg/L标准中间溶液。0.1%甲酸溶液稀释定容标准中间溶液配制系列标准溶液，浓度分别为：0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 mg/L，现用现配。1.3样品前处理称取试样2 g，加入20 mL甲醇振荡提取20 min，9 000 r/min离心5 min，准确移取上清液0.5 mL加入2 mL 0.1%甲酸，混匀。MCX（60 mg/3 cm）固相萃取，小柱依次经3 mL甲醇、3 mL水活化，备用液全部上柱，分别使用3 mL水、3 mL甲醇淋洗；挤干使用3 mL的5%氨水甲醇洗脱，洗脱液在50 ℃水浴条件下氮气吹干，使用1 mL 0.1%甲酸溶液复溶，经过0.22 μm滤膜，采用UPLC测定。1.4色谱条件色谱柱：Thermo Hypersll GOLD C18柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；柱温：35 ℃；检测波长：280 nm；进样量：10 µL；流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：乙腈；流速：0.3 mL/min。梯度洗脱程序：0~3 min，95%~85% A；3~4 min，85% A；4~6 min，85%~15% A；6~7 min，15% A；7.0~7.1 min，15%~95% A；7.1~11 min，95% A。2结果与分析2.1提取剂的选择（见表1）向空白基质中添加浓度为20 mg/kg的样品，比较甲醇、乙腈、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、甲醇：0.1 mol/L盐酸（1∶1，v∶v）和甲醇：0.1％甲酸（1∶1，v∶v）7种不同提取溶剂的提取效率。由表1可知，当提取溶剂为纯有机试剂时，甲醇的提取效果最高。当甲醇中加入水系溶液时，如0.1 mol/L盐酸和0.1%甲酸，米诺地尔的提取效率略有下降，出峰位置出现干扰物质。将甲醇提取后的残渣进行二次提取，残渣中未检出米诺地尔，表明甲醇的提取效率较高，故确定甲醇为提取剂，且提取1次。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.028.T001表1不同提取剂提取效率的比较（n=5）提取剂添加浓度/(mg/kg)测定值/(mg/kg)回收率/%甲醇2021.02105.10乙腈206.1930.95乙酸乙酯204.8424.20叔丁基甲醚201.376.85甲醇∶0.1 mol/L盐酸2017.2086.00甲醇∶0.1％甲酸2017.8889.40甲醇提取后残渣二次提取0未检出02.2净化条件的确定由于本试验目标药物只有一种物质，分离要求相对简单。因此，在同样稀释倍数的前提下，对比甲醇提取后直接稀释法、经PRiME HLB固相萃取小柱（60 mg/3 cm）和混合型阳离子（MCX）固相萃取小柱（60 mg/3 cm）固相萃取3种前处理方法，不同净化方法样品中米诺地尔回收率见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.028.F001图1不同净化方法样品中米诺地尔回收率注：样品添加浓度为10 mg/kg。由图1可知，直接稀释法无法很好地除去添加剂预混合饲料中的杂质，目标药物的回收率在50%~70%。当选用PRiME HLB（60 mg/3 cm）固相萃取法时，回收率几乎无改变；选用MCX（60 mg/3 cm）时，样品净化效果明显，杂质明显减少，所有不同饲料中目标药物的回收率均可达70%以上。因此，试验选择MCX固相色谱小柱更为合适。2.3线性关系根据前期调研工作的结果，猪用预混合饲粮样品中米诺地尔的含量为10~100 mg/kg。因此，本试验精密取适量米诺地尔标准工作液，使用0.1%甲酸将其稀释至浓度为0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 mg/L的标准曲线系列工作溶液，以目标物峰面积对其质量浓度绘制标准曲线，线性方程为y=218 575x+6 759.8，相关系数（R2）为0.999 6。结果显示，在0.05~10.00 mg/L范围内，米诺地尔工作曲线线性良好。2.4检出限、定量限、平均回收率和相对标准偏差依据信号与噪声比例，即s/n≥3的浓度作为检出限，s/n≥10的浓度作为定量限的原则，确定添加剂预混合饲料中米诺地尔的最低检出限为2 mg/kg，定量限为5 mg/kg。在确定样品预处理方法后，选择空白猪用添加剂预混合饲粮样品作为测试对象。米诺地尔为禁用药物，需要考察定量限、2倍定量限、10倍定量限不同浓度的添加回收试验。由于米诺地尔在实际的混合型饲粮添加剂中检出含量为0.4%，根据添加剂与混合饲粮常用配比计算，预混合饲粮中还将考察200 mg/kg高浓度的加标回收率试验。加标回收率试验每批次内同一浓度做6次平行试验，共重复3批次，猪用添加剂预混合饲粮的准确度及精密度，见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.028.T002表2猪用添加剂预混合饲粮的准确度及精密度（n=6）批次添加量/（mg/kg）批内平均回收率/%批内RSD/%批间平均回收率/%批间RSD/%1588.670.489.74.0286.670.4393.672.311085.770.286.21.2286.770.2386.070.115080.110.179.41.0280.980.1377.090.1120074.003.173.64.5275.835.1370.842.1由表2可知，饲粮样品在5~200 mg/kg范围内的批内回收率在70.84%~93.67%，批内相对标准偏差（RSD）在0.1%~5.1%；批间回收率在73.6%~89.7%，批间RSD在1.0%~4.5%。3结论研究建立了猪用添加剂预混合饲粮中新型非法添加物米诺地尔的确证定量检测方法。针对饲料样品基质特性，本方法与化妆品中米诺地尔的检测不同，在前处理过程中选用了有机相提取，结合固相萃取技术，高效快速地除去饲料样品中复杂的基质干扰，检测结果准确灵敏。本方法的建立填补了饲料样品中新型非法添加物米诺地尔的检测空白。