马立克氏病（MD）是由马立克氏病病毒（MDV）引起的一种高度传染性淋巴组织增生性肿瘤病，发病率和病死率均较高。MDV是一种严格的细胞结合型病毒，可根据血清学反应分为MDV-Ⅰ型、MDV-Ⅱ型、MDV-Ⅲ型，但只有Ⅰ型具有致病性[1-2]。20世纪70年代，国际上开始采用火鸡疱疹病毒（HVT）苗预防MD[3]；20世纪80~90年代起，MDV开始朝毒力更强的方向进化[4]，MD的疫苗也随之增加。但超强毒株突破了CVI988以及814疫苗毒株的保护力造成免疫失败[5]，造成多种病原的继发及共同感染。因此，及时诊断对MD防控具有重大意义。MDV是双链DNA分子，基因组约180 kb，由2个单链环通过一个双链臂连接而成，包括末端长短重复序列以及内部长短重复序列[6]。MDV基因组上功能区域可分为主要致瘤基因meq[7]、与毒株毒力相关的132-bp重复序列[8]、与免疫抑制相关的pp38/pp24磷蛋白基因[9]、与免疫逃避相关的v-il8基因[10]以及1.8 kb基因家族[9-11]；与诱导免疫应答相关的糖蛋白基因gB、gC、gD、gE等；尚未阐述清楚功能的其他基因。运用CRISPR/Cas9基因编辑技术[12]、黏粒和BAC克隆等技术[13]构建的meq基因缺失毒株的致瘤性明显减弱，表明meq基因作为致瘤基因在MDV肿瘤形成发展过程中具有至关重要的作用[14]。试验对Gen Bank发表的140余株MDV序列进行全基因组比对，选定MDV-Ⅰ型特有的meq基因设计1对引物，通过优化退火温度等条件建立了MDV-Ⅰ的PCR诊断方法，评估该方法的特异性、灵敏度及重复性，以期为MD的防控提供参考。1材料与方法1.1试验材料MD病死鸡的肝组织分离自某鸡场。MDV-Ⅰ型毒株、CVI988、814疫苗毒株均由武汉科前生物股份有限公司馈赠。HVT、鸡传染性贫血病毒（CIAV）、鸡传染性支气管炎病毒（IBV）、鸡传染性法氏囊病毒（IBDV）、禽白血病病毒（ALV）、鸡包涵体肝炎病毒（IBHV）、禽流感病毒（AIV）、新城疫病毒（NDV）、鸡胚成纤维细胞（CEF）均由本实验室保存。EasyTaq® DNA Polymerase（北京全式金生物技术有限公司）；DNAiso Reagent试剂盒（宝生物工程（大连）有限公司）。1.2引物设计与合成根据全基因组比对以及Gen Bank上发表的meq基因设计1对引物meq-F及meq-R，引物由北京擎科生物科技有限公司武汉分公司合成。引物序列见表1。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.08.012.T001表1引物序列Tab.1Sequence of primers名称序列（5'→3'）PCR产物长度/bpMDV野毒株CVI988/814疫苗株SC9-1MDV-SDmeq-FACTCCTCCACCTCCCTCACC286463无条带无条带meq-RGAGGGCAGAAGAGGGAATGGG1.3PCR扩增1.3.1样品基因组制备复苏CEF细胞，将MDV接种于CEF细胞，待细胞病变约为70%时收取细胞，采用DNAiso Reagent试剂盒提基因组。取部分疑似MD病死鸡的肝组织，剪碎成米粒大小的组织块，提取基因组的同时提取CVI988、814、CIAV、IBV、IBDV、ALV、IBHV、IAV、NDV、CEF细胞基因组。1.3.2PCR诊断方法的建立扩增体系（总体积为25 μL）：以1.3.1中提取的MDV-Ⅰ型毒株以及CVI988、814、HVT疫苗毒株基因组为模板，各取1 μL；EasyTaq®-DNA Polymerase 0.5 μL、10× EasyTaq®-buffer 2.5 μL、dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL、上游引物和下游引物各1 μL（10 μmol/L）。扩增程序：单蒸水补足至总体系为25 μL，设置35个循环数，95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，62 ℃退火5 s，72 ℃延伸30 s，循环35次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析以及测序分析。1.3.3PCR特异性试验采用1.3.1中提取的MDV-Ⅰ型毒株、814疫苗毒株、CIAV、IBV、IBDV、ALV、IBHV、IAV、NDV、CEF基因组为模板，运用确定的反应条件进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，评估其特异性。1.3.4PCR敏感性试验将1.3.1中提取的MDV-Ⅰ型毒株、814疫苗毒株、CEF基因组进行NANO DROP定量，调整至终浓度为10 g/mL后，做10倍比稀释，连续稀释5个梯度为模板（10.000、1.000、0.100、0.010、0.001 g/mL），以反应条件进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，判断其敏感性。1.3.5PCR重复性试验将1.3.1中的MDV-Ⅰ型毒株、CVI988、814疫苗毒株、CEF基因组进行PCR检测，每个模板设置3次重复，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，评估稳定性。1.3.6对1例疑似免疫失败鸡的检测以MDV-Ⅰ型毒株、814疫苗毒株、疑似MD病死鸡肝组织基因组、CEF基因组为模板，运用确定的PCR条件进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析后送测序判断检测结果。2结果与分析2.1PCR诊断方法（见图1~图3）由图1可知，MDV-Ⅰ型毒株基因组扩增得到286 bp条带，CVI988、814疫苗毒株扩增得到463 bp条带，HVT疫苗毒株未扩增出相应条带。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.08.012.F001图1MDV PCR诊断方法Fig.1Diagnostic method of PCR for MDV注 ： M为DL-5000 Marker；1为814疫苗毒株；2为CVI988疫苗毒株；3为MDV-Ⅰ毒株；4为HVT疫苗毒株。将扩增条带送测序，测序结果显示MDV-Ⅰ型毒株扩增条带与MDV-Ⅰ型毒株基因序列匹配（见图2）；疫苗毒株扩增条带与疫苗毒株基因序列匹配（见图3）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.08.012.F002图2MDV-Ⅰ测序结果Fig.2Sequence results of MDV-Ⅰ注 ： 上述比对序列中1~418为NCBI MDV-Ⅰ型毒株序列，1~388为测序结果；图9同。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.08.012.F003图3MDV疫苗毒株测序结果Fig.3Sequence results of MDV vaccine virus注 ： 上述比对序列中1~418为NCBI疫苗毒株序列，1~388为测序结果；图10同。2.2MDV PCR检测特异性试验结果（见图4）由图4可知，MDV-Ⅰ型毒株基因组扩增得到286 bp条带，CVI988、814疫苗毒株扩增得到463 bp条带，其他均未扩增出条带。结果表明，研究建立的PCR方法能够特异性扩增MDV-Ⅰ型毒株和疫苗毒株，并对二者进行区分。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.08.012.F004图4MDV PCR检测特异性试验结果Fig.4Specificity test of PCR for MDV注 ： M为DL-5000 Marker；1为CVI988疫苗毒株；2为814疫苗毒株；3为MDV-Ⅰ毒株；4为IBHV；5为CIAV；6为ALV；7为IBV；8为IBDV；9为AIV；10为NDV；11为阴性对照（CEF）。2.3PCR敏感性试验结果（见图5、图6）由图5、图6可知，以MDV-Ⅰ型毒株基因组PCR扩增为模板的检测下限为0.010 g/mL，以814疫苗毒株基因组PCR扩增为模板的检测下限为0.010 g/mL，表明本研究建立的PCR方法存在较高敏感性，适用于MDV检测。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.08.012.F005图5MDV-Ⅰ PCR检测敏感性试验结果Fig.5Sensitivity test of PCR for MDV-Ⅰ注 ： M为DL-5000 Marker；1为10.000 g/mL；2为1.000 g/mL；3为0.100 g/mL；4为0.010 g/mL；5为0.001 g/mL；6为CEF。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.08.012.F006图6814 PCR检测敏感性试验结果Fig.6Sensitivity test of PCR for 814注 ： M为DL-5000 Marker；1为10.000 g/mL；2为1.000 g/mL；3为0.100 g/mL；4为0.010 g/mL；5为0.001 g/mL。2.4PCR重复性试验结果（见图7）由图7可知，3次试验结果一致且均扩增出与预期相符的条带，表明研究建立的PCR方法具有良好的重复性。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.08.012.F007图7MDV PCR检测重复性试验结果Fig.7Repetitive test result of PCR for MDV注 ： M为DL-5000 Marker；1为814疫苗毒株；2为CVI988疫苗毒株；3为MDV-Ⅰ毒株；4为CEF。2.5对1例免疫失败鸡的检测（见图8~图10）由图8可知，可扩增得到286、463 bp条带，分别与野毒株、疫苗毒株大小符合。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.08.012.F008图8MDV免疫失败试验结果Fig.8MDV immune failure test result注 ： M为DL-5000 Marker；1为814疫苗毒株；2为MDV-Ⅰ毒株；3为病死鸡肝组织基因组；4为CEF。由图9、图10可知，扩增序列与MDV-Ⅰ型毒株和疫苗毒株的序列匹配，确诊该疑似MD病死鸡为免疫失败。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.08.012.F009图9免疫失败鸡MDV-Ⅰ测序结果Fig.9Sequencing result of MDV-Ⅰ in immune-failed chickensXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.08.012.F010图10免疫失败鸡MDV疫苗毒株测序结果Fig.10Sequencing result of MDV vaccine virus in immune-failed chickens3讨论本研究经MDV全基因组序列分析发现，CVI988、814疫苗毒株的meq基因相较于MDV-Ⅰ型毒株插入了177 bp的碱基。本研究基于meq基因177 bp插入处，设计引物，运用该引物以MDV-Ⅰ型毒株为模板可扩增得到286 bp的片段，以CVI988、814疫苗毒株为模板可扩增得到463 bp的片段，诊断MDV-Ⅰ型并鉴别其与疫苗毒株；通过特异性试验、敏感性试验以及重复性试验评估，表明该方法特异性强、敏感性高、重复性稳定。应用该方法检测1例接种过疫苗但感染疑似MDV-Ⅰ型毒株病死鸡组织，可同时扩增得到约463和286 bp的片段；2个片段测序结果与预期序列相符，确诊该病死鸡为免疫失败造成的死亡。本试验建立的MDV PCR诊断方法应用于临床实践中可及时对鸡群进行MD防控，保障养禽业的健康发展。MDV不断变异，其毒力也不断增强。为研制预防MDV超强毒株的疫苗，Su等[15]研究中构建了meq基因缺失株GX0101Δmeq，并筛选获得了具有良好复制能力且在一定程度上能够有效控制超强MDV的SC9-1候选疫苗株，但仍需大量的临床数据验证该疫苗候选株的安全性。刘长军等[16]分别通过两次同源重组构建了meq基因缺失中间体病毒毒株与meq基因缺失疫苗株rMS△meq，在该研究中构建的重组病毒同样具有良好的免疫保护效力。目前市场上广泛采用的CVI988和814疫苗毒株在最近几年频繁出现免疫失败的情况[17]。因此，能够及时、准确地诊断MD并对MDV-Ⅰ型毒株和疫苗毒株进行区分至关重要。本研究建立的PCR检测方法能够区分MDV-Ⅰ型毒株和现有的CVI988和814疫苗毒株及SC9-1疫苗株和meq基因缺失疫苗株rMS△meq。MD疫苗免疫失败还可能存在的原因是雏鸡早期感染CIAV、禽网织内皮组织增生症病毒（REV）等免疫抑制病破坏鸡群的免疫功能。MD感染鸡群常常和ALV、CIAV、REV等共同感染[18-19]，CIAV和REV均可抑制马立克氏病疫苗的免疫应答，使MDV在感染鸡体内不断增殖[20-21]，导致MD的严重性和影响性进一步扩大。本试验建立的检测方法能够特异性扩增MDV-Ⅰ型毒株和疫苗毒株，对CIAV、ALV、IBV、IBDV、IBHV、IAV、NDV均无扩增，展现出较高的特异性。本试验建立的MDV诊断方法特异性好、敏感性高、重复性稳定，适用于临床应用。4结论本试验建立的MDV-Ⅰ的PCR诊断方法可快速有效地诊断MD，区分MDV-Ⅰ和疫苗毒株，筛选免疫失败的鸡群，为快速诊断和区分MD提供了参考。