葡萄渣的营养丰富、易收集、成本低，其主要成分包括葡萄皮、葡萄籽和葡萄梗。葡萄渣作为新型饲料原料，可以缓解饲料资源短缺问题，在反刍动物生产中应用[1]。葡萄渣中含有较高的纤维素类物质，影响其作为粗饲料在动物日粮中的添加比例。主要采用发酵法解决该问题。近年来，关于葡萄渣的发酵主要以酵母菌单菌和乳酸菌作为菌源进行发酵[2-3]，对屎肠球菌和植物乳杆菌混菌发酵的研究较少[4-5]。本研究以屎肠球菌和植物乳杆菌制剂发酵葡萄籽为主的配合饲料，对其发酵产物进行综合分析，获得发酵葡萄籽配合饲料的适宜参数，为葡萄籽配合饲料的开发利用提供参考。1材料与方法1.1试验材料葡萄籽购自新疆伊犁某葡萄酒厂；屎肠球菌（1×106 CFU/kg）由塔里木大学郭雪峰课题组提供；植物乳杆菌（1×109 CFU/kg）购自沃德生物有限公司。1.2试验设计试验分为A1组（屎肠球菌制剂）、A2组（植物乳杆菌制剂）、A3组（屎肠球菌∶植物乳杆菌比为1∶1）、A4组（屎肠球菌∶植物乳杆菌比为2∶1）和A5组（屎肠球菌∶植物乳杆菌比为1∶2）。葡萄籽、麸皮和棉籽壳粉（6∶1∶1）粉碎，过40目筛，原辅料混匀装于发酵袋中，每袋分装100 g，将活化的屎肠球菌菌液和植物乳杆菌菌液均匀喷洒在混合饲料中。发酵袋密封后分别在20、25和30 ℃恒温培养箱内发酵24、48、72和96 h。发酵结束测定以葡萄籽为主的饲料样品营养成分、pH值、氨态氮/总氮（AN/TN）。1.3测定指标及方法采用凯氏定氮法测定粗蛋白质（CP）含量；使用脂肪浸提仪测定粗脂肪（EE）含量；使用美国ANKOM2000i全自动纤维分析仪测定中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）含量。称取10 g样品，加入90 mL蒸馏水，放入4 ℃冰箱24 h，使用四层纱布过滤，使用FiveEasy FE22 pH仪测定pH值。采用苯酚-次氯酸钠比色法测定氨态氮含量，计算AN/TN[6]。1.4数据统计与分析数据采用SPSS 26.0软件中的单因素方差分析进行显著性检验，LSD法多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1两种菌制剂在不同温度下对葡萄籽配合饲料常规养分含量的影响2.1.1两种菌制剂在20 ℃条件下对葡萄籽配合饲料常规养分含量的影响（见表1）由表1可知，发酵时间不同，A5组葡萄籽配合饲料发酵产物EE含量显著高于其他组（P0.05）。发酵时间增加，A2组、A3组和A4组NDF含量先增加后降低，ADF含量明显降低，水分含量无明显差异。发酵24 h各组ADF含量高于其他发酵时间。A5组的CP含量为12%~14%，在各发酵时间时均高于其他组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.015.T001表1两种菌制剂在20 ℃条件下对葡萄籽配合饲料常规养分含量的影响发酵时间/h项目EENDFADF水分CP24A1组8.12±0.84c32.11±1.5539.06±1.1954.08±0.168.50±0.40cA2组9.41±0.62c39.21±1.2235.21±1.3953.16±1.6811.60±0.73abA3组11.06±0.81b32.01±1.1231.22±1.2651.98±1.1810.70±0.41bA4组9.05±0.17c34.22±1.4137.40±1.3253.78±0.159.72±0.44bA5组13.37±0.32a32.66±1.2835.37±1.0653.43±0.1213.84±0.78aP值0.0000.2560.2480.5890.00848A1组10.48±0.79b26.19±1.22c17.09±1.00a54.06±0.178.98±0.44bA2组11.11±8.25b49.23±1.19a12.33±1.21b52.81±1.3411.80±0.41abA3组12.45±0.51b49.39±1.05a17.00±1.47a53.99±0.0510.60±0.85abA4组11.67±0.29b40.11±1.02b22.10±1.52a54.45±0.549.94±0.85bA5组15.40±0.61a39.33±1.33b14.88±1.78b54.02±0.9213.85±0.05aP值0.0000.0000.0060.5080.00872A1组9.35±0.63b32.41±1.03b18.31±1.2153.49±0.809.47±0.75bA2组10.71±0.48b38.04±1.07a13.45±1.6353.81±0.2514.10±0.38aA3组11.18±0.16b35.06±1.76a19.81±1.0349.35±1.3210.68±1.67bA4组10.86±0.11b35.22±1.43a15.45±1.0353.57±0.2210.16±0.72bA5组14.82±0.27a27.76±1.21c15.34±1.3753.81±0.2012.80±1.11abP值0.0000.0230.5040.6470.02696A1组9.88±0.54b34.22±0.0117.11±1.21b54.26±0.2110.44±0.43bA2组10.68±0.67b34.26±0.0116.09±1.13b53.11±2.9012.87±0.41aA3组11.51±0.40ab33.31±0.0217.23±1.44b51.90±3.6110.16±0.02bA4组9.18±0.47b34.09±0.0122.42±1.24a52.84±0.2210.19±0.74bA5组13.91±0.41a34.06±0.0113.89±1.31c53.01±0.7112.85±1.68aP值0.0080.0990.0410.5110.035注：同列同一时间数据肩标无字母或字母相同表示差异不显著（P0.05），不同字母表示差异显著（P0.05）；下表同。%2.1.2两种菌制剂在25 ℃条件下对葡萄籽配合饲料常规养分含量的影响（见表2）由表2可知，发酵48 h的A1组和发酵72 h的A3组，EE含量分别是15.57%、15.43%，明显高于24、96 h各试验组EE含量。发酵48 h的A1组、A5组，NDF含量均在28%以下，显著低于48 h的A2组、A3组和A4组（P0.05）。相同发酵时间，A5组的CP含量均为最高25 ℃几乎各试验组CP含量比20 ℃有所降低。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.015.T002表2两种菌制剂在25 ℃条件下对葡萄籽配合饲料常规养分含量的影响发酵时间/h组别EENDFADF水分CP24A1组13.63±0.32a32.13±2.23b29.23±2.12ab53.26±1.278.50±0.45bA2组11.43±0.18b38.21±3.01a34.21±1.06a53.82±0.5511.60±0.50abA3组12.05±0.54ab28.33±1.64c20.67±1.05c55.27±2.2110.70±0.41aA4组12.80±0.28ab33.31±2.03b32.34±1.43a57.11±3.1910.44±1.15aA5组12.03±0.25ab27.22±2.01c26.34±1.34b53.70±6.0311.18±0.84aP值0.0480.0010.0350.5890.03948A1组15.57±0.23a26.34±1.21c27.21±2.2153.24±1.007.95±0.83abA2组12.99±0.44b49.33±1.22a13.97±1.0353.63±0.2310.21±0.68aA3组13.40±0.63ab49.12±1.47a21.33±1.0453.89±0.1810.92±1.48aA4组13.65±0.40ab39.23±1.23b23.66±2.3251.69±5.219.00±0.42abA5组14.02±0.26ab27.46±1.23c19.34±1.2252.38±2.8211.66±0.41aP值0.0360.0000.0620.5040.00072A1组12.58±0.04b31.22±3.12b29.33±2.1253.71±0.6110.17±0.73bA2组13.38±0.55ab38.22±1.23a14.67±1.8754.22±0.319.21±0.43bA3组15.43±0.61a25.45±1.31c23.33±1.0353.17±7.8713.70±0.42aA4组11.92±0.06b38.34±1.43a18.33±1.0653.70±1.5810.68±0.81bA5组11.16±0.19b27.23±1.23c13.87±1.0259.78±0.1112.43±1.13aP值0.0000.0000.4320.6470.02696A1组12.50±0.33a30.23±1.02b27.21±1.0754.40±0.4311.40±0.46abA2组12.54±1.28a36.34±1.05a13.77±2.2153.05±1.4910.67±0.39bA3组14.75±0.77a20.34±1.05c21.32±1.0353.89±0.2811.10±0.43abA4组10.83±0.36b31.23±1.02b16.34±1.1348.47±11.9412.10±0.45abA5组13.03±1.50a30.34±1.01b12.33±1.3149.88±8.6113.87±0.44aP值0.0080.0000.4510.5110.025%2.1.3两种菌制剂在30 ℃条件下对葡萄籽配合饲料常规养分含量的影响（见表３）由表3可知，48 h各组EE含量最高，24 h的A5组、48 h的A5组和72 h的A5组等中性洗涤纤维含量分别是26.27%、26.33%、23.44%，明显低于24、48、72 h其他各组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.015.T003表3两种菌制剂在30 ℃条件下对葡萄籽配合饲料常规养分含量的影响发酵时间/h组别EENDFADF水分CP24A1组14.05±0.81ab33.38±1.23a24.34±1.2253.54±0.918.67±0.80bA2组11.35±0.40c34.45±1.33a27.18±1.3352.86±0.2610.44±0.87aA3组15.08±0.50a29.24±1.52b28.63±1.3753.61±0.4112.89±0.45aA4组14.05±0.04ab30.23±1.33ab28.55±1.3449.52±4.0411.42±0.43aA5组12.12±0.40bc26.27±2.21c26.22±2.0252.18±0.299.40±0.85bP值0.0000.0000.2480.5890.00948A1组15.68±0.65a32.04±1.32c17.03±2.0553.21±0.4610.90±0.70bA2组13.77±0.35b49.33±1.34a16.42±1.2252.71±0.0411.16±0.86bA3组12.65±0.29a49.42±1.33a20.42±2.0356.18±3.4212.63±0.73aA4组14.24±1.19ab39.34±1.47b20.34±2.4448.02±4.1112.64±0.05aA5组15.50±0.58b26.33±1.32c18.32±1.2353.75±0.3413.15±0.85aP值0.0000.0000.0620.5040.00072A1组13.86±0.43a35.34±1.66a16.33±1.0853.37±0.4711.40±0.43abA2组11.83±0.19b35.42±1.21a15.34±1.3253.19±0.2210.45±0.41bA3组14.50±0.39a31.66±2.08b19.33±1.2454.04±0.2113.38±0.71aA4组13.27±0.13a34.52±1.16a20.67±0.8452.32±3.5912.80±0.41abA5组13.33±0.42a23.44±3.24c20.83±1.2152.90±6.5610.93±0.03bP值0.0000.0000.4320.6470.02696A1组13.20±0.16a37.24±1.24a16.43±1.5552.45±0.1311.57±0.79bA2组11.56±0.39b36.34±1.23a16.39±1.4349.95±0.2312.40±0.43abA3组13.30±2.93a29.76±1.45c18.22±1.2452.46±1.7513.12±0.85aA4组12.25±0.25b33.48±1.06b18.08±1.6749.35±4.2014.62±0.43aA5组14.78±1.64a30.47±1.23c18.29±1.5853.94±0.4610.95±0.70bP值0.0080.0000.4510.5110.025%2.2两种菌制剂不同温度对葡萄籽配合饲料发酵pH值、AN/TN的影响2.2.1两种菌制剂在20 ℃条件下对葡萄籽配合饲料pH值、AN/TN的影响（见表4）由表4可知，随着发酵时间增加，各试验组pH值逐渐降低，24 h的A1组、A2组、A3组等pH值分别是5.16、5.14、5.16，显著高于A4组、A5组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.015.T004表4两种菌制剂在20 ℃条件下对葡萄籽配合饲料pH值、AN/TN的影响发酵时间/h组别pH值AN/TN/%发酵时间/h组别pH值AN/TN/%24A1组5.16±0.01a4.41±0.48c72A1组4.66±0.19a5.08±0.46cA2组5.14±0.01a4.06±2.02cA2组3.82±0.03b7.18±1.25aA3组5.16±0.01a6.46±0.82aA3组3.43±0.03b5.26±1.46cA4组3.23±0.03b5.35±0.78bA4组3.58±0.03b6.22±1.49bA5组3.20±0.04b5.27±2.32bA5组3.58±0.03b4.88±0.98dP值0.0020.046P值0.0380.04248A1组4.12±0.04a5.27±1.45c96A1组3.89±0.026.85±0.03aA2组4.40±0.07a5.23±2.10cA2组3.40±0.094.20±1.73cA3组4.39±0.03a5.92±1.48bA3组3.10±0.035.94±0.91bA4组3.01±0.07b7.12±1.69aA4组3.56±0.015.63±3.29bA5组4.82±0.02a4.56±2.18cA5组3.53±0.035.11±1.23bP值0.0050.035P值0.5140.00424 h的A1组、A2组，48 h的A5组，72 h的A5组和96 h的A2组等AN/TN分别是4.41%、4.06%、4.56%、4.88%、4.20%，明显低于24、48和96 h的其他试验组。2.2.2两种菌制剂在25 ℃条件下对葡萄籽配合饲料pH值、AN/TN的影响（见表5）由表5可知，24 h的A1组、A5组，48 h的A1组、A2组、A5组，72 h的A1组、A5组和96 h的A1组等AN/TN分别是4.13%、4.69%、4.49%、4.62%、4.71%、4.88%、4.99%、3.62%，显著低于24、48、72和96 h的其他组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.015.T005表5两种菌制剂在25 ℃条件下对葡萄籽配合饲料pH值、AN/TN的影响发酵时间/h组别pH值AN/TN/%发酵时间/h组别pH值AN/TN/%24A1组4.25±0.015.78±0.84a72A1组3.31±0.014.88±1.40A2组4.12±0.024.13±0.63cA2组3.58±0.015.56±1.31A3组4.24±0.055.34±0.83abA3组3.15±0.025.12±0.75A4组3.19±0.025.08±3.52bA4组3.55±0.085.76±1.14A5组3.15±0.014.69±0.18bA5组3.58±0.014.99±1.69P值0.1090.018P值0.2360.78848A1组3.21±0.014.49±0.80c96A1组3.17±0.033.62±0.16dA2组3.82±0.014.62±1.65cA2组3.53±0.045.43±1.52bA3组3.12±0.125.92±2.98bA3组3.06±0.027.26±1.56aA4组3.61±0.316.52±1.96aA4组3.56±0.027.06±1.06aA5组3.72±0.134.71±0.46cA5组3.44±0.155.22±1.46cP值0.2440.024P值0.6140.0152.2.3两种菌制剂在30 ℃条件下对葡萄籽配合饲料pH值、AN/TN的影响（见表6）由表6可知，发酵24 h，A3组的pH值为3.19，显著低于A1组、A2组、A5组（P0.05）。发酵48、72、96 h各试验组pH值低于4.0。发酵时间不同，各组AN/TN差异不明显。24 h的A1组、A4组，48 h的A2组、A4组、A5组，72 h的A4组，96 h的A2组、A4组等AN/TN分别是4.43%、3.91%、4.28%、4.24%、4.66%、4.89%、4.76%、3.53%，明显低于24、48、72和96 h的其他试验组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.015.T006表6两种菌制剂在30 ℃条件下对葡萄籽配合饲料pH值、AN/TN的影响发酵时间/h组别pH值AN/TN/%24A1组5.14±0.01a4.43±1.42dA2组5.15±0.01a5.24±0.52cA3组3.19±0.01b7.78±0.96aA4组4.19±0.01ab3.91±0.65dA5组5.19±0.01a6.86±2.01bP值0.0000.02548A1组4.94±0.036.88±1.22aA2组4.22±0.604.28±0.48cA3组3.69±0.025.74±2.38bA4组3.78±0.034.24±1.18cA5组3.79±0.074.66±0.78cP值0.1250.03472A1组4.00±0.036.19±0.20aA2组3.37±0.045.92±0.59bA3组3.58±0.035.08±2.09cA4组3.69±0.034.89±1.79cA5组3.66±0.025.27±1.08bP值0.1430.02496A1组3.64±0.016.78±1.15aA2组3.28±0.014.76±0.74cA3组3.52±0.016.52±1.47aA4组3.65±0.014.53±1.28cA5组3.35±0.015.62±2.35bP值0.6140.0233讨论3.1两种菌制剂不同温度对葡萄籽配合饲料常规养分含量的影响有研究表明，添加屎肠球菌和植物乳杆菌制剂的固态发酵饲料可以改善原料的常规养分和发酵品质[7-8]。刘永衡等[9]研究表明，葡萄籽中脂类物质含量占14%~17%，葡萄籽是葡萄渣中脂质的主要来源。孙亚楠等[10]添加里氏木霉和植物乳杆菌发酵菊芋渣，结果表明，发酵产物EE含量有所增加，发酵饲料品质得到改善，试验组发酵产物粗脂肪含量达到15%。本试验在不同温度下采用屎肠球菌和植物乳杆菌制剂发酵葡萄籽配合饲料，结果表明，A5组在20 ℃发酵48 h和72 h对常规养分改善效果最佳，随发酵时间增加，各试验组EE含量有所增加，与上述研究结果一致。CP是评价饲料品质好坏的关键指标之一[11]，葡萄品质不同，葡萄籽的粗蛋白含量也不同，一般情况下葡萄籽的蛋白含量在6%~15%[12]。添加了屎肠球菌和植物乳杆菌制剂各试验组发酵产物的CP含量有所增加。游小凤[13]在金针菇菌糠微贮时添加乳酸菌，粗蛋白含量提高了13.72%~27.76%，本研究结果与其相似。NDF和ADF是评价饲料适口性的主要指标之一。邓荟芬等[14]添加不同浓度黑曲霉菌液时，NDF和ADF含量显著降低。本试验结果表明，添加了屎肠球菌和植物乳杆菌制剂后NDF和ADF含量在17%~35%，可能是在微生物生长繁殖过程中产生了漆酶和木聚糖酶等纤维素和半纤维素降解酶，水分在49%~57%，不影响发酵品质。3.2两种菌制剂不同温度对葡萄籽配合饲料pH值、AN/TN的影响屎肠球菌和植物乳杆菌是良好的益生菌，属于乳酸菌，在生长过程中有机酸是其代谢产物之一。有机酸能够降低发酵底物的pH值，抑制菌株生长，使发酵饲料具有酸香味，改善发酵品质[15-16]。本试验结果表明，A5组在20、25 ℃对发酵品质改善效果最优，添加不同菌制剂，随着发酵时间的增加pH值先降低后稳定在3.0左右，pH值的变化与张恩宇等[17]对四种玉米品种全株青贮效果比较分析的研究结果相似，推测可能是屎肠球菌和植物乳杆菌在代谢过程中产生乳酸堆积过多，抑制了菌株的生长代谢[18]。AN/TN也是评价发酵饲料品质的关键指标[19]。AN/TN越小，表明微生物消耗掉的粗蛋白越少，微生物在发酵过程中会产生菌体蛋白。因此，AN/TN越低，发酵品质越好。本试验结果表明，随发酵时间的增加，AN/TN逐渐降低，AN/TN的变化与李顺等[20]通过添加糖蜜和纤维素酶对籽粒苋进行混合青贮，极显著降低籽粒苋与麦麸混合青贮AN/TN的试验结果相似。4结论本试验条件下，屎肠球菌与植物乳杆菌1∶2、在20 ℃发酵48 h，是以葡萄籽为主配合饲料发酵的适宜发酵参数。