食品中的呈味物质有很多种，大多是由亲水性的小分子或离子组成，其中包括呈味肽、氨基酸、糖类、有机酸等[1-3]。呈味肽可与味蕾上的特异性受体结合产生作用，能够明显改善食品味道或者掩盖不良风味，进而呈现出不同的滋味，包括甜、苦、酸、咸、鲜等[4-6]。鲜味肽可在保证其他滋味不被破坏的前提下，进一步提升其呈味的浓厚感与风味。鲜味肽在食品增味方面具有突出贡献[7-9]。制备鲜味肽的主要来源多为海鲜制品和动物蛋白，在其他来源中鲜少出现。目前，酶解豆粕是当下饲料行业中的研究热点，鲜味肽能在酶解豆粕的基础之上增强饲料的滋味，提升饲料的香味及诱食性。因此，文章从酶解豆粕蛋白的角度入手探讨制备鲜味肽的研究新进展，分析当前研究中存在的问题，为酶解豆粕蛋白制备鲜味肽的进一步研究提供参考。1酶解豆粕蛋白的研究概况1.1豆粕蛋白豆粕中粗蛋白含量高达43%~48%，碳水化合物含量约为10%~15%，营养均衡、氨基酸组成丰富合理[10]。但是，对豆粕蛋白的利用存在单一低效的问题，造成大量蛋白资源浪费。主要原因是：（1）豆粕蛋白的相对分子质量较大结构紧密，动物不易吸收利用。（2）豆粕中含有多种抗营养因子：一方面，抗营养因子会抑制动物体内部分消化酶的作用并与营养物质络合生成不易于消化吸收的成分，使消化吸收率下降；另一方面，抗营养因子会使动物体内的胰脏器官产生应激反应，对动物的生理生长造成不良的影响[11]。1.2酶解豆粕蛋白特点随着发酵技术、酶技术等现代生物技术的发展和各种酶制剂产品的广泛应用。酶解豆粕和发酵豆粕能有效地降低或消除大豆蛋白中的脲酶、抗胰蛋白酶、凝血素等部分抗营养因子，极大程度上分解大分子蛋白，提供短链小肽等优质蛋白源，具有提高诱食性、消化吸收率，促进生长等功效，提高豆粕蛋白的利用率，增强经济效益[12]。但是，豆粕进行发酵处理存在耗时较长、损耗较大、生长条件要求严格、不易控制、不宜大规模推广等缺点。酶解豆粕具有反应高效可控、反应条件温和、氨基酸成分稳定、不易发生消旋反应、反应产物容易纯化提炼等特点[13-14]。经过酶解处理的蛋白比传统大豆蛋白更易于吸收、抗原含量低等营养特性和生理功效，是幼龄动物的理想植物饲料蛋白[15-17]。2鲜味肽的制备方法鲜味肽的制备方法主要包括提取法、化学法、生物工程法、酶解法。不同方法获得的鲜味肽性质、纯度、功能等方面不尽相同，制备方法的选择尤为重要[18]。不同的制备方法都有各自的特点。提取法是借助特定的提取方式如加热、均质、超声波、微波等手段从动、植物中提取出天然鲜味肽。天然鲜味肽大多低毒、无污染但是提取后的产物成分复杂而且提取手段不可控，不易投入生产[19]。化学法分为化学水解和化学合成法。化学水解法是在酸性或者碱性条件下使蛋白质发生水解反应生成多肽或者氨基酸。酸碱水解具有快速、彻底的特点，但是反应条件不易控制，容易引起消旋作用，多肽的结构及功能受到影响，某些敏感氨基酸易被破坏，部分会有一定的毒性和致癌性[20-21]。化学合成法分为液相合成和固相合成两种方法，载体的使用选择是两者的主要区别，化学合成法需要考虑消旋作用的问题[19]。生物工程法是指从动、植物基因组中分离出带有目的基因的 DNA片段或者根据遗传信息合成该片段，然后将此DNA片段克隆至适当的载体并采用特定方法将其导入受体细胞，通过细胞表达获得所需的活性肽[22]。用该方法合成的鲜味肽虽然能够特异性合成目的肽链，但是所需技术较为复杂、成本过高。上述几种制备鲜味肽的方法都有各自的优点，但同时也存在许多缺陷，不适于生产。而酶解法生产鲜味肽成为当前研究的热点。酶解法是指底物在酶的水解作用下降解为低分子量的呈鲜味物质，再经过分离提取最终得到鲜味肽。酶解法具备多种独特的优点：第一，酶解法的条件温和，是一种不彻底的水解。它的产物主要是多肽，所以不会破坏某些敏感的肽类和氨基酸；第二，用酶解法制备鲜味肽是在保证其原有营养物质的前提下对蛋白质进行水解生成更优质的蛋白资源，可以在食品加工中深度利用[23]；第三，酶解后的产物纯度高，更易于分离提取，为生产工艺减轻负担，易于在市场上推广。3酶解豆粕蛋白制备鲜味肽的方法3.1水解酶的选择在酶解豆粕蛋白工艺中，蛋白酶的选择和使用方式是制备的关键。蛋白水解酶大多来源于微生物、动物和植物中，例如黑曲霉、胃蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、木聚糖酶等[24]。按照蛋白酶的功能可以将其分内切酶和外切酶。内切酶的作用是断开蛋白质分子内部的肽键，从而形成小分子肽链；而外切酶作用是断开蛋白质氨基或羧基末端的肽键，使其形成游离氨基酸。还有一些蛋白酶作用于酯键或酰胺键，进而得到分子量更小的多肽。蛋白酶具有专一的特性，不同的酶水解同一类底物时催化位点不同。所以，采用不同的蛋白酶水解相同的蛋白质时也会产生不同的多肽和氨基酸，导致产物的呈味特点产生变化。戴志远等[25]分别采用碱性蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶 、中性蛋白酶对小梅鱼蛋白进行水解，发现碱性蛋白酶的单酶水解效果较好。3.2水解酶的使用方法水解酶的使用方式也是影响酶解效果的重要方面。可以分为单酶酶解、复合酶酶解、分步酶解和微生物发酵酶解。单酶酶解是最基础的酶解方式，即用一种蛋白酶对大分子蛋白进行水解得到多肽和氨基酸。然而单酶水解存在产物种类单一、效率不高等缺点，逐渐被复合酶水解技术取代。复合酶水解即双酶或多酶联合水解，两种或多种具有协同作用的蛋白酶共同发生反应能够大大提升酶解效率、回收率和水解度。Beal等[26]研究发现，用3种蛋白酶组合成复合酶酶解生大豆和豆粕，氮的消化率显著增加，大分子蛋白显著被降解。虽然复合酶酶解进一步提高酶解效率，但是仅利用具有协同作用的蛋白酶进行水解还无法得到更具营养价值的小分子短肽。分步酶解法即先用一种酶使蛋白质的折叠结构打开，然后采用另一种功能酶更针对性的作用于肽键，以此提高原料的转化效率，可生成分子量更小的肽链。Per等[27]和Mcneil[28]在碱性蛋白酶和Nettrase双酶分步水解制备大豆肽的研究中，不仅得到小分子肽，还能减弱短肽的特殊苦味。Arai等[29]和张根生等[30]分别利用风味蛋白酶中的外切酶对复合蛋白酶水解产物进一步水解，继续断裂肽链，并通过协同作用增加水解液的风味。张昆[31]和杨洁芳等[32]分别通过不同的菌酶协同方式对饼粕类和大豆蛋白进行水解研究，结果表明，通过菌酶协同的水解方式后底物中游离棉酚等抗营养因子的含量明显下降，脱毒率达73%，氨基酸和小肽的含量大幅升高。3.3酶解条件的优化当水解酶的种类和添加方式确定后，还需对酶解条件的各项参数工艺进行进一步的选择和优化。对酶解产生影响的工艺参数主要有料液比、水解温度、pH值和水解时间。孙潇等[33]探讨了酶解条件参数对豆粕酶解过程中呈味物质释放规律的影响，研究表明，肽态氮的含量随着酶解温度、pH值、酶解时间的增加均呈现先增加后降低的趋势。酶条件的参数选择会对酶解过程产生重要影响。因此，许多研究者都通过响应面法等手段对酶解法制备鲜味肽的工艺参数进行筛选，最终得到最佳酶解条件（见表1）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.01.043.T001表1不同酶解法制备鲜味肽的酶解条件底物来源类型酶解条件水解度/%参考文献豆粕单酶酶解料液比1:10（g/mL）、木瓜蛋白酶添加量3%、时间1 h、pH值6.5、温度55 ℃0.03邓梦琴等[12]豆粕单酶酶解料液比1:10（g/mL）、蛋白酶FPK（蛋白酶重组高产菌株发酵）添加量3 500 U/g、pH值8.5、时间8 h、温度60 ℃67.88董鹏[18]豆粕复合酶酶解料液比2:7（g/mL）、木瓜蛋白酶300 U/g，β-葡聚糖酶、纤维素酶、植酸酶、α-半乳糖苷酶和果胶酶500 U/g、时间24 h、温度40 ℃—魏金涛等[16]豆粕复合酶酶解料液比1:12（g/mL）、Protamex复合酶添加量2 859 U/g、胰蛋白酶添加量4 920 U/g、pH值7.5、时间10 h、温度50 ℃21.80马成业[34]豆粕复合酶酶解中性蛋白酶和复合蛋白酶总酶添加量4 000 U/g、pH值6.69、时间4 h、温度50 ℃21.51王慧云等[35]豆粕复合酶酶解碱性蛋白酶:中性蛋白酶:胰蛋白酶比3:2:1、酶添加总量5 000 U/g、pH值8.5、时间4.5 h、温度50 ℃94.55林洋等[36]豆粕复合酶酶解料液比1:10（g/mL）、复合酶中性和蛋白酶酶总添加量4 000 U/g、pH值6.5、时间4 h、温度50 ℃—孙潇等[33]海带复合酶酶解料液比1:50（g/mL）、酶添加量0.3%、pH值6.38、时间7.64 h、温度52.60 ℃24.94温志鹏[37]辣椒粕复合酶酶解料液比1:10（g/mL）、复合蛋白酶:风味酶=2:1、总酶添加量为2%、时间6 h、pH值6.5、温度50 ℃19.44赵静等[38]紫苏粕微波分步酶解第1步：碱性蛋白酶添加量1 600 U/g、 pH值10.0、微波温度60 ℃、微波时间35 min 第2步：风味蛋白酶添加量1 600 U/g、pH值6.5、微波温度65 ℃、微波时间40 min44.86李荣等[39]大豆微生物发酵酶解碱性蛋白酶添加量为240 U/g、枯草芽孢杆菌1398接种量2.0%、加水量165%、时间36 h、温度44 ℃—杨洁芳等[32]注：“—”表示文献中没有具体表明蛋白水解度含量。4酶解豆粕制备鲜味肽存在问题及改善4.1苦味及脱苦豆粕经过酶解后，肽链断开，大分子的蛋白被分解，疏水性侧链被暴露，因此酶解后的产物会呈现苦味[40]。鲜味肽脱苦的方法有分离法、掩盖法、酶法。分离法包括吸附分离、沉淀分离、萃取分离、超滤分离。分离法脱苦可能会损失部分氨基酸[41]。掩盖法脱苦常用环状糊精疏水空腔将苦味肽包裹来掩盖其苦味，但是用量较大，不宜投入工厂化。部分有机酸也可以掩盖苦味，如苹果酸、柠檬酸等，但会使产物呈现酸味[42]。酶法脱苦是较为常见的方法，外切酶可将蛋白质及多肽分子末端的氨基酸肽键水解，使这些疏水性氨基酸与目标肽链分开。但是酶的种类会对水解液的味道产生较大影响，所以酶的选择尤为重要[43]。Izawa等[44]采用氨肽酶水解大豆蛋白和酪蛋白，去除水解物的N端疏水性氨基酸使苦味降低。4.2鲜味不足及增鲜酶解豆粕蛋白制备鲜味肽与酶解动物蛋白的产物相比风味和鲜味不足。动物蛋白天然的风味与鲜味较为丰富，植物蛋白需要增强鲜味才能达到更佳的滋味。增鲜主要是通过添加复合酶来进行酶解反应，风味蛋白酶就是一种较好的增鲜蛋白酶[45]。还可利用鲜味的协同作用提升鲜味，在酶解过程添加蛋白酶和氨基酸，氨基酸的加入可反向促进酶解液中鲜味肽的生成[46]。4.3产物不纯及纯化富集酶解法制备鲜味肽存在分子量大小、结构、组成不同的差异。酶解后的产物种类较多、不纯，难以直接获得目标肽类，还需要进一步纯化富集并找到更经济实用操作性强的纯化方法。目前，鲜味肽的分离纯化的方法主要是超滤膜分离法、凝胶过滤色谱分离法、大孔吸附树脂分离法、高效液相色谱法等。超滤膜分离和凝胶过滤分离法的分离原理是根据分子量的大小对酶解液进行初步分离富集，可按照分子量的大小得到不同组分，以此筛选出所需肽类。大孔吸附树脂法是根据大孔树脂的物理性特性来吸附特定的有机物质，以达到分离纯化的目的。Zhuang等[47]初步分离后使用反向高效液相色谱技术对酱油中的肽类进行细化分离，最终得到3种鲜味肽。5展望酶解法降解蛋白条件温和，不会产生致癌物和其他毒素，产物含营养小肽且含盐量低。未来研究可从菌酶协同酶解的方式继续深入，蛋白酶的酶解作用不能消除植物蛋白中的抗营养因子，因此需要与微生物发酵结合，达到更佳的效果。此外，辅助微波可以缩短酶解时间。