鸡传染性支气管炎是由冠状病毒科、γ冠状病毒属的传染性支气管炎病毒（infections bronchitis virus，IBV）引起一种急性、高度接触性传染病[1]，该病主要侵害呼吸系统、消化道和泌尿生殖系统[2]。此外，感染鸡也易受到支原体、细菌或其他病原体的继发感染，导致病死率增加[3]。IBV为有囊膜、不分节段的单股正链RNA病毒，基因组大小约为27.6 kb，主要编码突糖蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白和刺突蛋白等4种结构蛋白[4]。在病毒成熟的过程中，S糖蛋白翻译后被切割，分为S1和S2亚基，其中S1蛋白决定血清型，并被认为在保护性免疫的诱导中发挥重要作用[5]。S1基因n端氨基酸的突变直接导致新血清型的出现和组织嗜性的改变[6]，目前已有报道超过50种IBV血清型[7]。由于IBV的血清型较多，且毒株之间的交叉保护作用弱或没有交叉保护作用，对鸡传染性支气管炎的防控和养禽业产生了一定影响。临床上鸡传染性支气管炎与禽流感和鸡传染性喉气管炎等呼吸道疾病的症状相似，影响了鸡传染性支气管炎的鉴别诊断。因此，对IBV的快速检测也成为预防和控制鸡传染性支气管炎的关键，针对IBV建立特异性检测方法也显得尤为重要。本研究通过比对IBV M基因的保守区域，设计并合成特异性引物及探针，通过优化反应条件，建立检测IBV的一步法实时定量RT-PCR方法。此方法可应用于IBV的早期检测，为鸡传染性支气管炎的防控提供了一定参考。1材料与方法1.1试验材料IBV（辽宁分离株）尿囊液由辽宁省锦州市动物疫病预防控制中心提供；19份已知背景的IBV病料由辽宁益康生物股份有限公司提供。传染性候气管炎活疫苗K317株（生产批号：202104）、鸡痘活疫苗（生产批号：202104）、鸡新城疫活疫苗LaSota株（生产批号：202101）、传染性法氏囊病活疫苗B87株（生产批号：202025）、鸡新城疫活疫苗CS2株（生产批号：202015）均购自哈药集团生物疫苗有限公司。1.2主要试剂One Step PrimeScriptTM Ⅲ RT-qPCR Mix试剂盒、DL2000 DNA Marker、PMD-18T载体、DH5α感受态细胞（大连宝生物工程有限公司）；病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；2×Taq Master Mix（江苏康为世纪生物科技有限公司）、快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（南京维诺赞生物科技有限公司）；第一链cDNA逆转录试剂盒、荧光定量八连管（赛默飞世尔科技有限公司）。1.3主要仪器ABI 7500Fast实时荧光定量PCR仪（赛默飞世尔科技有限公司）、PCR基因扩增仪（瑞士Blue Marlin公司）、恒温振荡器（常州万科仪器科技有限公司）等。1.4试验方法1.4.1引物设计与合成通过对13条IBV M蛋白基因序列比对分析，采用Oligo7软件在M基因保守区域作为靶基因设计1对引物及TaqMan探针，在探针5'端标记荧光报告基团FAM，3'端标记荧光淬灭基团BHQ1。引物及探针合成由大连宝生物工程有限公司完成。特异性引物及探针序列信息见表1。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.07.001.T001表1特异性引物及探针序列信息Tab.1Specific primers and probe sequence information引物序列（5'→3'）片段长度/bpA1GTCCAACGAGACAAATTG175A2CCAGAAACACCATAACAC探针AATAAGCCGACTCCTAGTTGCGT1.4.2引物退火温度的筛选参照徐敏等[8]关于实时定量荧光RT-PCR退火温度筛选方法，采取普通PCR确定本试验的退火温度。从病毒尿囊液中提取RNA并进行反转录，使用反转录后的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR总反应体系（30 μL）：2×Taq Master Mix 15 μL、A1引物1 μL、A2引物1 μL、模板3 μL，剩余部分采用灭菌ddH2O补足。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，50、52、54、56、58、60 ℃梯度退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环35次；72 ℃延伸10 min，对基因序列进行扩增。PCR反应结束后于2%琼脂糖凝胶电泳检测。1.4.3标准质粒样品的制备以制备的cDNA为模板，A1、A2为引物，使用PCR方法扩增获得特异性条带；对目的片段进行琼脂糖凝胶电泳回收以及纯化；将回收产物连接至PMD-18T载体中，置于DH5α感受态细胞中转化。选取独个菌落置于LB液体培养基中（氨苄青霉素：100 mg/L），37 ℃振荡培养10 h。从培养菌液中进行质粒提取，通过PCR方法对所得质粒进行鉴定，鉴定的阳性重组质粒送至上海生工进行测序，单个阳性重组质粒分别测定3次，确保所得基因序列准确，以测序正确的重组质粒为标准样品，使用紫外分光光度计对重组质粒进行浓度测定，并计算其拷贝数。拷贝数＝6.02×1023×浓度/质量分数（1）1.4.4一步法实时荧光定量RT-qPCR体系的初步构建使用One Step PrimeScriptTM Ⅲ RT-qPCR Mix试剂盒推荐的反应体系（20 μL）：One Step PrimeScript Ⅲ RT-qPCR Mix (2×)10 μL、PCR Feverse Primer (10 μmol/L) 0.4 μL、PCR Reverse Primer (10 μmol/L) 0.4 μL、Probe (10 μmol/L) 0.4 μL、ROX Reference Dye or Dye Ⅱ (50×)0.4 μL、RNA模板2 μL、M阳性质粒2 μL、RNase Free H2O 6.4 μL。反应条件：52 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，95 ℃退火5 s，56 ℃延伸30 s，循环40次。1.4.5一步法实时荧光定量RT-qPCR反应条件优化根据初步构建的方法对反应条件进行优化，引物分别在0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 μmol/L终浓度进行扩增，摸索最佳引物浓度。探针分别在0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 μmol/L终浓度进行扩增，摸索最佳探针浓度。比对扩增结果的Ct值和ΔR值，得到最优引物浓度和探针浓度。1.4.6标准曲线建立将M基因阳性标准质粒进行10倍梯度稀释，将其作为质粒标准品制作标准曲线；采用优化后的反应体系与反应条件进行一步法实时荧光定量RT-qPCR反应，同一样品重复3次，生成拷贝数与循环数对应的标准曲线。1.4.7敏感性试验将制备的M基因阳性标准质粒按10倍稀释成9个稀释度，分别将其作为模板，以优化后的反应体系与反应条件进行一步法实时荧光定量RT-qPCR反应，同时进行普通PCR扩增，对两种PCR方法的敏感性进行评价。1.4.8特异性试验以M基因阳性质粒、IBV分离株作为阳性对照，以鸡新城疫病毒CS2株和LaSota株、传染性法氏囊炎病毒（B87株)的RNA和鸡痘病毒和传染性喉气管炎的DNA为模板，采用建立的一步法实时荧光定量RT-qPCR方法进行扩增，评价此方法特异性。1.4.9重复性试验为评价一步法实时荧光定量RT-qPCR方法的可重复性，分别对3份不同浓度的阳性质粒标准品（1×106、1×105、1×104 copies/μL）在同一次反应中进行3次重复测定，计算每个样品各反应管之间的组内变异系数（CV/%）、Ct值及标准差。对上述样品分别进行3次测定，对同一样品每次测定结果之间的组间变异系数（CV/%）、Ct值及标准差进行计算。变异系数=标准差/平均值×100%（2）1.4.10临床应用检测采用建立的一步法实时荧光定量RT-qPCR方法及普通RT-PCR方法对辽宁益康生物股份有限公司提供的19份已知背景病料进行检测，分别计算其检出率。2结果与分析2.1引物退火温度的确定（见图1）由图1可知，对PCR产物进行琼脂糖凝胶梯度电泳，结果显示，引物在50~60 ℃均扩增出特异性条带（175 bp），并且退火温度在56 ℃时，扩增效率最高，故确定最佳退火温度为56 ℃。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.07.001.F001图1引物退火温度的确定Fig.1Determination of primer annealing temperature注 ： M为DNA Marker DL2000；1~6分别为：50、52、54、56、58、60 ℃；7为阴性对照。2.2标准质粒的鉴定及浓度测定M基因阳性重组测序质粒经上海生工测序后，与传染性支气管炎病毒分离株毒株进行比对，结果序列一致，见图2。采用紫外分光光度计测得质粒DNA浓度为21 mg/L，依据换算公式计算得出，重组质粒拷贝数为1.09×1011 copies/μL。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.07.001.F002图2M基因阳性质粒鉴定结果Fig.2Identification results of M gene positive plasmids注 ： M为DNA Marker DL2000；1~2为M基因阳性质粒。2.3一步法实时荧光定量RT-qPCR反应体系和反应条件的初步确定（见图3）由图3可知，成功扩增出传染性支气管炎病毒分离株和M基因阳性质粒，Ct值分别为16.044和14.661。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.07.001.F003图3一步法实时荧光定量RT-qPCR反应体系和反应条件的初步确定Fig.3Preliminary determination of one-step real-time RT-qPCR reaction system and reaction conditions2.4一步法实时荧光定量RT-qPCR反应条件的优化结果（见图4、图5）为达到最佳的敏感度及扩增效率，对引物浓度及探针浓度分别进行优化。由图4、图5可知，各浓度均出现有效扩增；引物浓度在0.3 mol/L时Ct值（13.943）最小；探针浓度在0.3 mol/L时Ct值（13.995）最小；优化结果显示最佳引物和探针浓度均为0.3 mol/L。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.07.001.F004图4IBV M基因引物浓度优化结果Fig.4IBV M gene primer concentration optimization resultXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.07.001.F005图5IBV M基因探针浓度优化结果Fig.5IBV Optimization results of M gene probe concentration2.5标准曲线的建立（见图6、图7）以10倍比稀释的质粒标准品（1.09×1010~1.09×102 copies/μL）为模板，使用一步法实时荧光定量RT-qPCR进行扩增，得到其动力学曲线及标准曲线。由图6、图7可知，各浓度均得到有效扩增，质粒标准品模板浓度与Ct值线性关系良好，斜率为-3.442，截距为41.185，扩增效率（Eff/％）=95.226，相关系数R2=0.991；以x轴为病毒起始拷贝数，y轴为扩增曲线Ct值，得到线性方程y=-3.442logx+41.185。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.07.001.F006图6一步法实时荧光定量RT-qPCR标准曲线Fig.6One-step real-time RT-qPCR standard curveXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.07.001.F007图7一步法实时荧光定量RT-qPCR扩增曲线Fig.7One-step real-time RT-qPCR amplification curve2.6敏感性测定结果（见图8、图9）由图8、图9可知，采用超纯水对质粒标准品进行10倍比稀释（1.09×109~1.09×101 copies/μL），一步法实时荧光定量RT-qPCR方法检测，检测下限是1.09×102 copies/μL模板浓度；常规RT-PCR结果显示，检测下限为1.09×104 copies/μL的模板浓度。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.07.001.F008图8一步法实时荧光定量RT-qPCR敏感性试验Fig.8One-step real-time RT-qPCR sensitivity testXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.07.001.F009图9常规PCR敏感性试验Fig.9Conventional PCR susceptibility test注 ： M为DNA Marker DL2000；1~9为1.09×109~1.09×101 copies/μL；10为阴性对照。2.7一步法实时荧光定量RT-qPCR特异性试验结果（见图10）由图10可知，只有M基因阳性质粒和IBV病毒分离株出现了特异性扩增，鸡新城疫病毒CS2与LaSota株、传染性法氏囊炎病毒B87株、传染性喉气管炎、鸡痘病毒以及阴性对照均未出现扩增，表明该方法特异性良好。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.07.001.F010图10一步法实时荧光定量RT-qPCR特异性试验结果Fig.10One-step real-time RT-qPCR specificity test result2.8一步法实时荧光定量RT-qPCR重复性试验结果（见表2）由表2可知，选取3个浓度阳性质粒标准品（1×104、1×105、1×106 copies/μL）作为模版，同时进行反应，对标准差（S）、变异系数（CV/%）进行计算，得出重复性试验组间以及组内变异系数均小于2%，重复性良好。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.07.001.T002表2一步法实时荧光定量RT-qPCR重复性试验结果Tab.2One-step real-time RT-qPCR reproducibility test result组别组间比较组内比较平均数标准差变异系数/%平均数标准差变异系数/%1×104 copies/μL19.7990.0260.13120.5720.0650.3161×105 copies/μL24.5620.3441.40024.4870.1060.4331×106 copies/μL26.7540.0920.34427.6090.2390.8662.9一步法实时荧光定量RT-qPCR临床应用检测结果（见表3）由表3可知，通过建立的一步法实时荧光定量RT-qPCR方法和普通RT-PCR方法对19份已知背景样品进行检测中。结果显示，两种方法均可检测出IBV，检出率分别为90％和74％。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.07.001.T003表3一步法实时荧光定量RT-qPCR临床应用检测结果Tab.3One-step real-time RT-qPCR clinical application test result项目阳性数/个阴性数/个检出率/%实时荧光定量PCR17290常规PCR145743讨论目前应用于IBV的检测方法大多集中针对N基因和S1基因，如王楷宬等[9]根据IBV的N基因进行引物和探针设计，建立了一种能够检测IBV的实时荧光RT-PCR方法。金娟等[10]针对分离毒株的S1基因区设计1对引物和TaqMan探针，建立了检测IBV的实时荧光RT-PCR方法。有研究报道，在IBV N基因上也会发生插入、缺失和突变等一些变异，病毒的某些生物学特性也可能因此而发生变化[11]。M蛋白是群特异性蛋白，保守性高，在IBV检测中起到重要作用[12]。本试验通过对13对鸡IBV的M基因进行对比分析，在保守区域设计了1对特异性引物及探针，建立了IBV的一步法RT-qPCR检测方法，使IBV的早期检测有了一种新的技术方案。染料法是目前对IBV病毒进行实时定量RT-PCR检测较多的一种方法[13-14]，该方法中的荧光染料能够在单链引物、错配产物及引物二聚体之间产生非特异性结合，导致结果出现假阳性。本研究采用一步法荧光定量RT-qPCR方法检测IBV，采用新型耐热性反转录酶，可在高温下（55 ℃）进行反转录反应，且阻害物质耐受性和再现性高。本方法不需要单独做反转录，反转录反应与qPCR反应在单个反应管中连续进行，操作简单，可以避免多次操作造成的污染问题；反转录反应只需5 min，至少减少一半的时间和费用，可较快得到检测结果。本研究建立的方法可对微量病毒进行检测，对质粒DNA标准品最低检测下限为1.09×102 copies/μL，敏感性是常规RT-PCR方法的100倍；特异性好，与其他4种常见鸡新城疫病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊炎病毒和痘病毒无交叉反应。提取19份已知背景病料基因组并进行检测，结果显示，本研究建立的方法检出17份阳性，检出率高于常规RT-PCR（检出14份阳性），表明一步法实时荧光定量RT-qPCR方法具有更高的检测效率，其应用前景也更加广泛。4结论本研究建立了IBV的一步法实时荧光定量RT-qPCR方法，该方法对质粒DNA标准品最低检测下限为1.09×102 copies/μL，敏感性比普通RT-PCR方法高100倍，与4种其他鸡病毒无交叉反应；重复性试验组间以及组内变异系数均小于2%；经过临床样品检测显示，此方法检出率明显优于普通RT-PCR。