牛病毒性腹泻-黏膜病（BVD-MD）主要特征为发热、咳嗽、黏膜病变、消化道线性病变、白细胞减少、免疫抑制、持续感染等[1]；妊娠母牛感染该病还可能导致胎儿畸形、产死胎或流产等。BVD-MD可引起免疫抑制及持续感染，导致防控难度相对较大[2]。BVD-MD呈世界性分布，尤其在畜牧业发达的国家分布更广泛。20世纪80年代，我国首次报道了BVD-MD的感染情况，截至目前，我国多个地区已有该病的相关报道，严重危害我国养牛业[3]。本文简述了BVD-MD的生物学特征、国内外流行情况、临床类型、诊断方式以及该病的防治方法，为BVD-MD的进一步研究提供一定参考。1BVD-MD的生物学特征BVD-MD由牛病毒性腹泻病毒（BVDV）引起[4]。BVDV与猪瘟病毒（CSFV）、绵羊边界病毒（BDV）同属黄病毒科、瘟病毒属[5]。BVDV具有包膜，为单股RNA病毒，分子大小约为12.4 kb，编码的序列主要可分为3部分：5'UTR、OFR以及3'UTR[6]。5'UTR长度约为380 bp，根据此序列可将BVDV进行基因分型，可分为BVDV1型和BVDV2型，其中BVDV1型已被分为22个基因亚型（1a~1v），BVDV2型分为4个基因亚型（4a~1d）[7]。OFR区编码4个结构蛋白和7个非结构蛋白。3'UTR的长度约为230 bp左右，其中包括对病毒复制具有重要作用的原件，具有较高的保守性。BVDV结构近似球形，沉淀系数约80~90 S，直径约40~60 nm[8]。BVDV对胰酶、乙醚、氯仿等有机溶剂具有相对较高的敏感性，酸性环境下极易失去活性，在碱性环境下具有一定的耐受能力[9]。BVDV对于温度敏感性高，在56 ℃环境下，30 min即可失去活性。分离或者传代的BVDV在体外培养的难度不高，可在多种细胞中存活，目前应用于大多数实验室利用牛肾细胞（MDBK）进行的病毒增殖。根据细胞接种BVDV病毒后是否会导致病变，又可分为CP型和NCP型两种类型；一般情况下，CP型与病毒的致病性无关，自然环境中NCP型的数量大于CP型，当感染NCP型病毒时可引起细胞发生核固缩、产生空泡、细胞溶解、死亡等[10]。2国内外BVD-MD的流行情况20世纪60年代，美国首次报道BVD-MD，之后加拿大、秘鲁、法国、罗马尼亚、英格兰、澳大利亚也陆续发现该病。20世纪90年代，一项血清学检测的调查结果显示，北美BVD-MD的阳性率50%~80%，秘鲁50%~90%，法国76%~95%，罗马尼亚64%~90%，英格兰62%~85%，澳大利亚89%~95%[11]。其中北美国家以BVDV1a和BVDV1b、2a型等基因型较为常见[12]，欧洲国家以BVDV1b型较常见，大洋洲则以BVDV1c型较常见[13]。20世纪80年代，我国分离到第一例BVDV，之后我国的多个省市自治区均有BVD-MD的相关报道，逐渐引起了人们对BVDV-MD的重视。2013年，李栋梁等[14]对北京地区的BVD-MD的发病情况进行了调查，结果显示，BVD-MD高风险牛场为12个。2015年，谭春萍等[15]对广西部分地区牛病毒性腹泻病毒流行情况进行了调查，结果显示感染率为3.41%。2016年，曲萍等[16]对西北地区BVD-MD流行情况进行调查，结果显示，所调查区域内群阳性率为84.38%,个体阳性率为61.88%。2017年，Deng等[17]对我国19个省的92个奶牛场进行了BVD-MD流行情况的调查，并对5'UTR进行测序，发现存在8种不同亚基因型的BVDV-1，包括1a、1b、1c、1d、1m、1q以及暂定为未知亚基因型“BVDV-1v”和“BVDV-1w”。2019年，郭启勇等[18]等对宁夏地区的BVDV流行情况进行检查，结果发现，抗原阳性率达到2.71%，且抗体阳性率已超过85%。2021年，王晨豫等[19]对新疆部分规模奶牛场采集血清和耳组织样本，并进行BVDV抗原检测，结果显示，血清抗原阳性率1.21%，耳组织检测阳性率1.17%。我国许多省份均有BVDV感染的情况，需要采取足够的重视以及相应措施，改善目前的情况。3BVD-MD的临床类型3.1持续感染持续感染（PI）是BVD-MD发生后出现的独特临床类型。NCP型BVDV可有效逃避宿主的免疫应答而发生PI，即妊娠母牛若在妊娠早期感染该病毒，由于胎儿早期免疫系统尚未发育完全，无法识别NCP型BVDV并产生有效的免疫应答[20]，导致与健康牛相比，PI牛发育迟缓且携带病毒；若PI牛排出病毒将引起其他牛感染。一般情况下，PI牛在6月龄至2岁因感染黏膜病（MD）而死，未死亡的成年PI牛繁殖的后代将一直携带BVDV[21]。因此，为控制BVD-MD传播，养殖场应做好PI牛的净化工作。3.2免疫抑制免疫抑制会在一定程度上损害机体的免疫能力，降低机体对其他疾病的抵抗能力。BVDV引起宿主动物发生免疫抑制，主要通过改变免疫细胞功能、降低反应能力、影响免疫细胞在机体内的分布，进而导致机体免疫功能下降，增加了其他病菌侵入机体的情况，引起继发感染[22]。3.3MDMD是BVDV发生感染而引起的一种最严重的临床类型，发病率、病死率高，犊牛以及亚成牛表现为腹泻、脱水等症状。NCP型BVDV与CP型BVDV的变化导致了MD较高的致死率。感染NCP型BVDV的妊娠母牛可产出PI犊牛，PI犊牛会对自身携带的NCP型BVDV产生免疫耐受，但再次感染到相同来源的CP型BVDV即可引起MD[23]；若感染不同来源的CP型BVDV将刺激动物的机体产生相应的抗体抵制新入侵的病毒。因此，在部分PI动物体内可检测到BVDV抗体。4BVD-MD的诊断方式4.1病毒分离鉴定病毒分离是病毒诊断的重要标准。当动物疑似感染BVDV时，将患病动物的组织器官进行相应的处理，接种于MDBK中，经过3~5代盲传后观察是否出现病变，收集病毒。该方法是BVDV诊断的金标准，但由于细胞培养存在难度要求高、试验周期长等缺点，故在诊断中应用较少。4.2RT-PCR法BVDV分为2个基因型，具有高度保守的5'UTR区域，以该区域为目的片段设计引物，运用RT-PCR法可以很好地对BVD进行诊断。2017年，王吉等[24]设计的BVDV RT-PCR检测方法具有检测速度快、特异性高、敏感性好等优点，检测BVDV1型和BVDV2型DNA模板浓度低至8.87×102 和6.31×102 copies/μL。2018年，李佳暖等[25]建立的BVD高效纳米PCR检测方法具有更优秀的敏感性，其最小检出BVDV量为15.2×10-4 mg/L。4.3荧光定量PCR法目前，荧光定量PCR法主要包括SYBR GREEN法和TapMan探针法，与PCR法相比，具有更好的特异性及灵敏度。2018年，王艳杰等[26]建立了双重TapMan探针法检测BVDV，Ⅰ型BVDV检测下限为10.0 copies/μL，Ⅱ型BVDV检测下限为100 copies/μL。2019年，任亚初等[27]建立SYBR GREEN法检测BVDV，检测下限为4.87×10 copies/μL。2021年，张康等[28]建立了TapMan探针法检测BVDV，检测下限为5.0 copies/μL。荧光定量PCR法检测BVDV具有很多优点，对BVD的早期诊断具有极高的临床意义。4.4ELISA法ELISA法非常适合大量的BVDV血清样本的检测，且目前技术已经相对成熟。2016年，常敬伟等[29]建立的BVDV抗体间接ELISA方法通过表达E2蛋白，包被纯化的蛋白；结果显示，与爱德士间接ELISA BVDV试剂盒相比，此检测方法的符合率为91.5%，与其他呼吸道综合征候群的疾病无交叉反应，可进行大批量样本的抗体监测以及流行病学调查。4.5间接免疫荧光PCR法、荧光定量PCR法等方法主要检测基因水平的物质，无法确定病毒的感染性。2017年，黄杰等[30]建立了BVDV间接免疫荧光检测法，以山羊抗牛BVDV抗体作为一抗，荧光素FITC标记的兔抗羊免疫球蛋白G（IgG）作为二抗，可以更好地检测BVDV病毒颗粒。上述间接免疫荧光检测法可检测疫苗中是否存在BVDV污染，并且可应用于BVDV的定位以及感染情况的研究。4.6RT-LAMP法RT-LAMP即逆转录和环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification）的结合，可应用于快速扩增RNA。此技术的特异性、灵敏度、检测范围优于RT-PCR法，同时还具有操作简单、无须专业设备的优点。2022年，张宇名等[31]建立了可视化一步RT-LAMP检测BVDV的方法，参照GENBANK上BVDV的5'UTR数据设计了两组引物，结果显示，最低检测下限为0.021 ng/L，且检测结果与商品化ELISA试剂盒相比，符合率为100%，具有良好的特异性、灵敏性，适用于临床诊断。5BVD-MD的预防与治疗BVD-MD存在较广泛，致病机制复杂，欧美国家防控BVD-MD的主要措施为扑杀PI动物、疫苗接种及加强监测。我国目前对该病的防治主要为注射疫苗，但也有部分地区尚未实行净化。5.1预防目前对BVD-MD等传染性疾病仍采取预防为主的方针，在发生疾病前即采取良好的预防措施，保证养殖户、养殖场能够更安全地进行生产活动[30]。应重视BVD-MD疫苗注射，保证疫苗的质量以及正确的使用方法，达到最佳的预防效果，并定期进行BVDV抗体监测。为切断传染源，应对PI牛进行抗体检测，首次检测后对PI牛进行隔离，21 d后若仍检测为阳性即进行淘汰。加强饲养管理，保证饲料营养均衡；饲养环境干燥且具有较好的通风性，提高动物的抵抗力，更好地防控BVD-MD[32]。5.2治疗目前尚无针对BVD-MD的特效药，故治疗BVD-MD仍主要在日常饲养管理、疾病预防等方面加强牛的抵抗力。若发生了BVD-MD疫情，需要迅速隔离患病牛并进行彻底的消毒，患病牛进行对症治疗、补充体液，降低由于抵抗力下降而继发感染其他疾病的风险[33]。圈舍以及饲养用具采用漂白粉进行消毒，出现口腔溃疡症状的患病牛采用高锰酸钾进行消毒处理。此外，也可结合中医疗法对患病牛进行治疗[34]。6结论BVDV结构复杂，基因具有多个亚型，变异性大，防控难度大。随着我国畜牧业不断发展，牛的进出口愈发频繁，促进了我国养牛业发展，但同时也对BVD-MD的检测和预防产生了更大的挑战。应加强饲养管理及防疫，以科学的方法进行临床诊断，预防BVD-MD发生。