为控制使用抗生素导致的多重耐药细菌的产生，我国自2020年7月1日起全面实施饲料禁抗，因此寻找新型安全、高效的替抗产品是目前的研究热点。蜂毒肽是蜜蜂毒腺中合成的抗菌肽之一，具有药学和医学特性[1]。日粮中添加蜂毒肽可提高动物生产性能、免疫力和抗氧化能力[2-3]，预防疾病[4]。本研究所采用的蜂毒素是一种运用代谢工程及分子育种技术获得的多肽产品，尚未开展对动物生理机能影响的研究。鹌鹑体型小、产蛋率高、可密集饲养，具有较高的经济价值，敏感性好、抗病力强、世代间隔短，已广泛用于生物学、畜牧学和生物医学等多领域的研究[5]。本试验在鹌鹑日粮中添加不同水平的蜂毒素，研究其对鹌鹑血清免疫指标、抗氧化能力、免疫器官指数和肠道免疫指标的影响，确定蜂毒素在日粮中的适宜添加量，为蜂毒素在鹌鹑养殖生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验设计鹌鹑购自河南省汝州市康宏养殖场。选取320只健康、体重相近的70日龄鹌鹑随机分成4组，每组4个重复，每个重复20只。Con组（对照组）为基础日粮、M1组为基础日粮+蜂毒素0.08 g/kg、M2组为基础日粮+蜂毒素0.12 g/kg、M3组为基础日粮+蜂毒素0.16 g/kg。试验期21 d。试验期间鹌鹑自由采食与饮水，基础日粮组成及营养水平见表1。蜂毒素（主要成分为蜂毒肽）由广东某生物农业科技有限公司提供。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.008.T001表1基础日粮组成及营养水平原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米51.09代谢能/(MJ/kg)12.10豆粕35.00粗蛋白质/%21.76豆油1.50粗纤维/%5.89鱼粉9.00粗灰分/%6.54磷酸氢钙0.70磷/%0.86石粉1.25钙/%2.95食盐0.30蛋氨酸0.13赖氨酸0.03预混料1.00注：1.预混料为每千克日粮提供：VA 12 000 IU、VE 30 IU、VD3 5 000 IU、VK3 2 mg、VB1 3 mg、VB2 5 mg、VB6 3 mg、VB12 1 mg、烟酸3 mg、泛酸800 mg、叶酸500 mg、生物素0.2 mg、胆碱1 500 mg、铜8 mg、碘42 mg、铁10 mg、锰10 mg、硒30 mg、锌25 mg。2.营养水平中代谢能为计算值，其余均为实测值。1.2测定指标及方法1.2.1生产性能每日记录投料量与剩料量和蛋重，试验结束后计算每只鹌鹑的平均日采食量、平均蛋重和料蛋比。平均蛋重=总蛋重/产蛋量(1)平均日采食量=每日总耗料量/每日个体数(2)料蛋比=总耗料量/产蛋总重(3)1.2.2血清免疫和抗氧化指标试验结束时，各重复抽取1只鹌鹑，空腹心脏采血，4 000 r/min离心10 min，-20 ℃保存，使用试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）检测免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、补体C3、干扰素-γ（IFN-γ）含量以及超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性和丙二醛（MDA）含量，操作步骤按照试剂盒说明书进行。1.2.3免疫器官指数试验结束后，各重复随机取选1只鹌鹑，颈静脉放血处死，取脾脏和胸腺称鲜重，计算免疫器官指数。免疫器官指数=器官鲜重/活体重(4)1.2.4肠道免疫指标取十二指肠、空肠和回肠，置于液氮内冷冻，转存于-80 ℃保存。根据总RNA提取试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司）操作说明书提取十二指肠、空肠和回肠的总RNA；NanoDrop 2000超微量分光光度仪（Thermo Fisher Technology Co., Ltd.）检测RNA浓度和纯度；1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。荧光定量RT-PCR（qPCR）检测十二指肠、空肠和回肠的IL-2和IFN-γ mRNA相对表达水平，引物序列见表2，由金智唯生物科技有限公司合成。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.008.T002表2引物序列基因引物序列（5'→3'）片段大小/bp登录号IL-2F：GTGCAAAGTACTGATCTTCGCC297XM_421035R：CTTGGTGTGTAGAGCTCGAGATGIFN-γF：GCCGCACATCAAACACATATCT207XM_001379309.1R：TGAGACTGGCTCCTTTTCCTTβ-actinF：CTGGCACCTAGCACAATGAA123NM_001124235.1R：CTGCTTGCTGATCCACATCT根据反转录试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司）操作说明将总RNA反转录为cDNA。qRT-PCR反应体系（20 μL）：10 μL 2×SYBR Green qPCR Master Mix、2.0 μL cDNA、上游和下游引物各0.4 μL、7.2 μL ddH2O。反应程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，重复40个循环。采用2-△△CT法计算mRNA相对表达量。1.3数据统计与分析采用GraphPad Prism 8软件（GraphPad Software, San Diego, California USA）进行统计分析，采用单因素方差分析显著性，Tukey-Kramer进行多重比较检验。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1蜂毒素对鹌鹑生产性能的影响（见表3）由表3可知，与Con组相比，M2组鹌鹑平均日增重显著增加（P0.05），M1组、M2组平均蛋重显著增加（P0.05）。M3组料蛋比显著高于M1组、M2组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.008.T003表3蜂毒素对鹌鹑生产性能的影响组别平均日增重/[g/(只·d)]平均蛋重/(g/枚)料蛋比Con组25.36±1.03b10.92±0.22c2.68±0.13abM1组25.70±1.28ab11.41±0.11b2.59±0.17bM2组26.83±1.26a11.83±0.07a2.56±0.14bM3组26.15±0.74ab10.95±0.06c2.79±0.11a注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2蜂毒素对鹌鹑血清免疫指标的影响（见表4）由表4可知，与Con组相比，M2组鹌鹑血清IgG、IgA、补体C3和IFN-γ含量均显著增加（P0.05），M1组和M3组各指标差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.008.T004表4蜂毒素对鹌鹑血清免疫指标的影响组别IgG/(g/L)IgA/(mg/L)补体C3/(mg/L)IFN-γ/(ng/L)Con组437.46±30.99b350.17±63.86b999.86±67.54b104.74±8.87bM1组521.78±68.01ab440.99±32.89ab1 107.83±43.57ab117.81±5.36abM2组544.96±39.33a452.94±39.58a1 259.71±85.47a126.23±3.31aM3组502.80±44.00ab415.16±36.16ab1 129.26±96.03ab108.80±6.21b2.3蜂毒素对鹌鹑血清抗氧化指标的影响（见表5）由表5可知，与Con组相比，M2组鹌鹑血清SOD、GSH-Px的活性显著提高（P0.05），MDA含量显著降低（P0.05）；M3组鹌鹑血清GSH-Px的活性显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.008.T005表5蜂毒素对鹌鹑血清抗氧化指标的影响组别SOD/(μg/L)GSH-Px/(μg/L)MDA/(μmol/L)Con组10.12±0.69b220.57±6.00b15.19±0.18aM1组11.24±0.51ab233.27±5.87ab14.99±0.83abM2组12.23±0.85a239.61±5.62a13.49±1.16bM3组10.78±0.73ab198.18±12.38c15.11±0.24a2.4蜂毒素对鹌鹑免疫器官指数的影响（见表6）由表6可知，各组鹌鹑脾脏指数、胸腺指数差异均不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.008.T006表6蜂毒素对鹌鹑免疫器官指数的影响组别脾脏重量/g脾脏指数/(mg/g)胸腺重量/g胸腺指数/(mg/g)Con组0.18±0.030.67±0.080.42±0.041.56±0.14M1组0.22±0.040.81±0.120.47±0.071.73±0.15M2组0.23±0.020.83±0.100.53±0.071.91±0.19M3组0.21±0.030.76±0.230.47±0.061.72±0.212.5蜂毒素对鹌鹑小肠IL-2 mRNA的影响（见图1）由图1可知，与Con组相比，M2组鹌鹑十二指肠、回肠IL-2 mRNA相对表达量显著增加（P0.05）。M2组鹌鹑十二指肠、空肠的IL-2 mRNA相对表达量均显著高于M3组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.008.F001图1蜂毒素对鹌鹑小肠IL-2 mRNA相对表达量的影响注：不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下图同。2.6蜂毒素对鹌鹑小肠IFN-γ mRNA的影响（见图2）由图2可知，M2组鹌鹑十二指肠和空肠的IFN-γ mRNA相对表达量显著高于其他3组（P0.05）。与Con组相比，M3组鹌鹑回肠IFN-γ mRNA相对表达量显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.008.F002图2蜂毒素对鹌鹑小肠IFN-γ mRNA相对表达量的影响3讨论3.1蜂毒素对鹌鹑生产性能的影响蜂毒素能够降低肉鸡平均日采食量[6]，提高兔的繁殖能力[3]。猪肠道抗菌肽[7]和抗菌肽Plectasin[8]均能够显著提高鸡的平均日采食量。添加抗菌肽天蚕素能够显著提高鸡料蛋比[9]；添加鲎素抗菌肽能够显著提高蛋鸡平均蛋重[10]。本研究结果表明，添加0.12 g/kg蜂毒素能够显著提高鹌鹑平均日采食量、平均蛋重，原因可能是蜂毒素促进了鹌鹑肠道中益生菌增殖，抑制有害菌群生长，促进机体对营养物质的消化吸收。3.2蜂毒素对鹌鹑血清免疫指标的影响血清免疫球蛋白含量是动物抵抗病毒和细菌等病原体入侵的能力的指标，IgA是机体黏膜防御系统的重要组成部分，是机体防止病原微生物入侵的第一道防线[11]。IgG是动物机体内含量最高的免疫球蛋白，参与抗菌、抗病毒、抗毒素等免疫反应，是动物机体免疫机制的主要抗体，可通过经典途径激活补体，对细胞性抗原可产生抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC）及调理作用[12]。本研究发现，日粮添加0.12 g/kg蜂毒素能够显著增加鹌鹑血清IgG和IgA含量，与其他报道一致。天蚕素[12]、抗菌肽Sublancin[13]、枯草芽孢杆菌天然抗菌肽[14]能够显著升高鸡血清IgG和IgA含量；蝇蛆抗菌肽能够显著增加鹌鹑血清IgG和IgA含量[15]。补体系统是动物血清中一种重要的先天免疫组成部分，在获得性免疫过程中发挥重要作用，参与机体抗微生物防御反应以及免疫调节，可介导免疫病理的损伤性反应。补体系统主要通过经典途径、凝集素途径和替代途径被级联激活。补体C3在补体激活过程中起关键作用，经典激活途径和替代激活途径均需在C3被激活之后推进后续补体成分的连锁反应[16-17]。人医领域中C3的基础及临床应用的研究很多[18-21]，但有关禽C3检测及在机体的变化情况报道较少。本研究结果发现，日粮添加0.12 g/kg蜂毒素能够显著提高鹌鹑补体C3的含量。抗菌肽能够显著提高鸡[22-23]、家兔[24]和貂[25]的血清补体C3含量。IFN-γ是一种具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的细胞因子，具有强大的调节机体免疫系统作用，是机体发挥免疫功能、清除体内病原体不可缺少的成分。日粮添加0.12 g/kg蜂毒素能显著提高鹌鹑血清IFN-γ含量。其他抗菌肽也可提高鸡血清IFN-γ的含量，如鲎素Tachyplesin I[26]、禽β-防御素（鸡）[27]和抗菌肽Sublancin[13]。研究表明，抗菌肽（蜂毒素）可提高鹌鹑的先天性免疫和获得性免疫，增强机体的抗病能力。3.3蜂毒素对鹌鹑血清氧化功能的影响养殖过程中，家禽可能受到各种不良应激因素（病原微生物、转群、换料等）的影响引起内环境稳态失衡，产生大量活性氧，扰乱体内氧化/抗氧化系统，导致氧化应激。抗氧化酶系统作为动物体内抗氧化应激的第一道屏障，能够反映活性氧的代谢水平及对组织的损伤水平，包括SOD、GSH-Px、CAT等。日粮中添加0.12 g/kg蜂毒素能够显著提高鹌鹑SOD和GSH-Px活性，显著降低MDA含量。蜂毒素能够显著增加家兔血清SOD和GSH-Px的活性，降低血清MDA含量[2-3]。蜂毒素可通过增加小鼠抗氧化能力缓解百草枯诱导的肺损伤和内毒素诱导的急性肾损伤[28-29]，提高动物适应环境的能力。3.4蜂毒素对鹌鹑免疫器官指数的影响器官指数在一定程度上可反映器官功能的强弱[30]。脾脏重量与感染期间次级淋巴组织内免疫细胞的增殖有关，胸腺在培育T淋巴细胞过程中具有关键作用[31]。免疫器官体积的变化受淋巴细胞凋亡与细胞增殖速度影响[32]，而抗菌肽在机体免疫调节和免疫稳态方面起重要作用[23]。抗菌肽能够显著增加鹌鹑胸腺指数[15]以及鸡脾脏指数、胸腺指数[33]。但也有研究表明，抗菌肽对鹌鹑、鸭或鸡的免疫器官无显著影响[26,32,34]。上述结果存在差异的原因可能是选用的抗菌肽种类及动物品种不同。本研究结果表明，日粮添加蜂毒素后能够不同程度地提高鹌鹑的脾脏指数和胸腺指数，其中0.12 g/kg组效果最佳。3.5蜂毒素对鹌鹑肠道IL-2和IFN-γ表达量的影响细胞因子是控制免疫细胞发育和应答的低分子量蛋白质，在宿主先天免疫中起重要作用[35]。细胞因子还具有调节组织修复、造血细胞生成、细胞生长和免疫功能[36]。细胞因子作为有效的免疫调节剂，抑制脂多糖（LPS）诱导的促炎细胞因子产生，充当趋化因子或诱导趋化因子产生，调节适应性免疫应答的树突状细胞或T细胞的反应[37]。IL-2是产生CD4+调节性T细胞的必要因子，通过促进CD4+ Treg分泌抑制性细胞因子，下调免疫应答，维持免疫稳态[38]。敲除IL-2基因可抑制CD4+ Treg功能，诱发炎症性肠病[39]。王秋波等[40]研究发现，蜂毒素可使机体的IL-2含量升高，增强Th1细胞功能，对机体细胞免疫功能起正向调节的作用，与本研究结论一致。此外，抗菌肽能够显著提高猪和小鼠血清IL-2的含量[41-43]，增加鸡脾脏IL-2 mRNA相对表达量[14]。IFN-γ可有效增强Ⅰ型干扰素的抗病毒活性，激活巨噬细胞，抑制肿瘤细胞增殖[44]。本研究结果表明，添加0.12 g/kg蜂毒素能够显著上调十二指肠和空肠IFN-γ mRNA表达水平。天蚕素可显著提高肉仔鸡空肠IFN-γ mRNA表达水平[45]和貂空肠IFN-γ的含量[25]，蜂毒素对回肠IFN-γ mRNA表达水平的影响出现负调节。天蚕素能够显著降低蛋用仔公鸡空肠IFN-γ mRNA相对表达水平[33]；抗菌肽Microcin C7能够显著下调肉仔鸡空肠IFN-γ mRNA相对表达水平[46]。本试验结果表明，在日粮中添加蜂毒素能够提高鹌鹑的肠道免疫力。4结论日粮中添加蜂毒素能够提高鹌鹑生产性能，增强机体免疫能力和抗氧化能力，以0.12 g/kg蜂毒素效果较好。