反刍动物的瘤胃具有复杂的微生物区系，瘤胃微生物可以将饲料中的营养物质分解成挥发性脂肪酸，合成微生物菌体蛋白质，促进宿主吸收[1]。反刍动物所需的B族和K族维生素由微生物合成[2]。Xue等[3]研究发现，瘤胃微生物与奶牛的饲料利用率、产奶量以及乳成分等生产性状之间存在紧密的相关性。刚出生的羔羊生长发育快、可塑性强，但青藏高原高寒、低氧、自然环境恶劣，且羔羊出生月份多为枯草期，母羊长期营养摄入不足导致羔羊死亡率提高，影响养殖效益[4-5]。因此，可通过调整日粮营养含量促进羔羊生长，提高青藏高原地区藏羊的生产性能[6]。玉米胚芽粕是玉米胚芽经过浸提或压榨提取玉米胚芽油后的副产品，属于纤维中等的能量饲料，可作为蛋白质和能量补充应用于家畜日粮中[7]。周贤文等[8]在猪日粮中添加发酵玉米胚芽粕，显著提高了生长猪的平均日增重，降低了料重比。本试验将营养成分全面、适口性较好、价格低廉的玉米胚芽粕添加到藏羔羊的基础日粮中，通过高通量测序技术探讨玉米胚芽粕对藏羔羊瘤胃菌群组成的影响，以期为藏羔羊日粮的配制提供参考。1材料与方法1.1试验设计选择健体况良好、体重为（21.67±2.13）kg的3月龄藏羊母羔32只，随机分为2组，每组16只，每组4个重复，每个重复4只羊。日粮精粗比为7∶3，试验组精料中加入12％的玉米胚芽粕。试验期共104 d，预试期14 d，正式试验期90 d。每日8：30与18：30饲喂2次，自由饮水。根据NRC（2001）绵羊饲养标准进行日粮的配制，试验精料组成及营养水平见表1；粗饲料由燕麦青甘草、燕麦青贮组成。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.006.T001表1试验精料组成及营养水平（干物质基础）原料组成/%试验组对照组营养水平试验组对照组合计100.0100.0玉米59.068.0消化能/(MJ/kg)13.1113.15菜籽粕26.226.2干物质/%82.2182.10棉粕02.0粗蛋白/%16.4816.45豆粕1.02.0粗脂肪/%3.283.28玉米胚芽粕12.00粗纤维/%4.124.04食盐0.80.8粗灰分/%2.542.47预混料1.01.0注：1.预混料为每千克精料提供：VA 24 000 IU、VD 4 400 IU、VE 400 IU、钴 0.22 mg、碘0.53 mg、硒0.34 mg、锰45 mg、锌28mg、铁58 mg、铜 20 mg。2.营养水平中消化能为计算值，其余均为实测值。1.2样品采集试验结束后，每组随机选取4只藏羊在颈静脉放血后屠宰，采集瘤胃液10 mL，经4层纱布过滤后，置于无菌离心管中，3 500 r/min离心15 min，取上清液，-80 ℃存放。1.3测定指标及方法1.3.1生长性能在正式试验期的第0 d和90 d，称取各组藏羊空腹体重，准确记录试验期间的采食量，计算藏羊的平均日增重、平均日采食量以及料重比。平均日增重=(末重-初重)/(试验羊数×试验天数)(1)平均日采食量=总采食量/(试验羊数×试验天数)(2)料重比=平均日采食量/平均日增重(3)1.3.2瘤胃微生物采用试剂盒（E.Z.N.A.stool DNA Kit）提取藏羊瘤胃液DNA。检测所提取的DNA质量及浓度，符合条件进行下一步的试验。应用Illumina 双端测序平台检测藏羊瘤胃微生物多样性，采用带有barcode的特异引物扩增16S rDNA的V3+V4区，引物序列为：F5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'，R3'-GGACTACHVGGGTATCTAAT-5'。利用Uparse，按97%的序列相似度，对OTUs进行归类。利用Shannon、Simpson、Chao1和Ace指数来分析细菌的丰富度和均匀度，基于未加权的Unifrac距离进行PCoA分析，应用QIIME进行各分类水平的分类学组成分析。1.4数据统计与分析利用SPSS 23.0统计软件，采用t检验法比较数据的差异显著性，结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1日粮中添加玉米胚芽粕对藏羔羊生长性能的影响（见表2）由表2可知，试验组藏羊末重、平均日增重显著高于对照组（P0.05），料重比显著低于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.006.T002表2日粮中添加玉米胚芽粕对藏羔羊生长发育的影响项目初重/kg末重/kg平均日增重/[g/(只·d)]平均日采食量/[g/(只·d)]料重比P值0.9820.0370.0280.0840.039试验组18.92±0.5436.65±1.24a197.01±10.27a1 549.23±50.877.86±0.52b对照组18.84±0.7633.78±1.08b159.98±15.09b1 601.12±60.2710.01±0.38a注：同列数据不同字母表示差异显著（P0.05），无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2日粮中添加玉米胚芽粕对藏羔羊瘤胃菌群OTUs数量的影响（见图1）试验测序共获得294 660个有效序列，然后通过Uparse软件对所有样本的全部有效序列聚类，基于97％将序列聚类为OTUs。由图1可知，8个样本共含有4 715个OTUs。对照组含有1 685个OTUs，试验组含有2 038个OTUs，共含有676个OTUs。本试验覆盖率大于99%，测序深度能够准确反映瘤胃细菌组成。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.006.F001图1玉米胚芽粕对藏羔羊瘤胃菌群OTUs数量的影响2.3日粮中添加玉米胚芽粕对藏羔羊瘤胃细菌Alpha多样性指数的影响（见表3）Chao1指数与Ace指数是描述物种丰富度的指数，数值越大表示群落丰富度越高。Shannon指数与Simpson指数是描述群落多样性的指数，Shannon指数越高（Simpson指数越低）表示群落更具有多样性。由表3可知，试验组的Ace指数、chao-1指数与Shannon指数显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.006.T003表3玉米胚芽粕对藏羔羊瘤胃细菌Alpha多样性指数的影响项目Chao1指数Ace指数Shannon指数Simpson指数P值0.0210.0370.0230.100试验组2 313.69±925.33a2 245.30±930.33a7.85±0.97a0.98±0.00对照组1 198.25±160.91b1 131.76±142.90b5.85±0.98b0.91±0.082.4日粮中添加玉米胚芽粕对藏羔羊瘤胃微生物Beta多样性的影响（见图2）通过PCoA可以观察个体或群体之间的差异。由图2可知，与对照组相比，试验组的个体聚集度较高，表明日粮中添加玉米胚芽粕，能够提高藏羔羊瘤胃菌群组成相似性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.006.F002图2基于未加权的Unifrac距离PCoA分析2.5日粮中添加玉米胚芽粕对藏羔羊瘤胃细菌含量的影响2.5.1瘤胃门水平细菌含量（见表4）由表4可知，拟杆菌门与厚壁菌门、变形菌门相对丰度较高，是藏羔羊瘤胃液优势菌门。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.006.T004表4瘤胃门水平细菌含量项目拟杆菌门厚壁菌门变形菌门酸杆菌门P值0.3100.4130.4070.125试验组48.96±23.2940.39±19.513.24±2.291.52±1.09对照组63.91±15.7329.15±12.942.07±0.561.21±0.64%2.5.2瘤胃科水平细菌含量（见表5）在科水平上对相似度大于97％的菌群进行统计分析，普雷沃氏菌科、瘤胃球菌科、毛螺菌科、S24-7、韦荣氏菌科相对丰度较高，为优势菌。由表5可知，试验组藏羊毛螺菌科数量显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.006.T005表5瘤胃科水平细菌含量项目普雷沃氏菌瘤胃球菌毛螺菌S24-7韦荣氏菌帕拉普氏菌克里斯滕森菌RF16琥珀酸弧菌BS11F16丹毒丝菌P值0.9510.1280.0440.1130.1430.5910.1040.7050.3460.3560.1280.491试验组14.40±10.5110.28±8.559.15±5.05a19.57±2.0218.20±2.803.55±2.422.19±1.002.17±1.642.06 ±2.131.70 ±1.481.52 ±1.513.02 ±0.01对照组14.77±3.6710.01±0.001.98±1.17b23.22 ±9.6022.92±15.634.37±0.972.01±1.041.75±1.130.81±0.430.76±0.871.50±1.243.87±2.02%3讨论3.1日粮中添加玉米胚芽粕对藏羔羊生长性能的影响调整日粮组成是影响反刍动物生长发育的常用方式[9]。在畜牧生产中，反刍动物的体重、日增重、料重比是衡量反刍动物生长发育的主要指标。玉米胚芽粕营养全面且价格低廉，适合应用于反刍动物生产中。周贤文等[10]研究发现，日粮中添加发酵玉米胚芽粕可显著提高生长猪的生产性能，能够有效地改善肠道形态和微生物区系。在日粮中添加10%玉米胚芽粕能够改善育肥猪的生产性能、血清生化指标和营养物质表观消化率[11]。本试验表明，日粮中添加玉米胚芽粕能够明显促进藏羔羊生长发育。料重比是体现反刍动物对日粮料利用效率的主要指标，料重比低表示饲料转化率较高[12]。本试验表明，日粮中添加玉米胚芽粕能够提高饲料利用效率，可能是因为玉米胚芽粕发酵的过程中会产生大量的乳酸，造成pH值下降，使其具有酸香味，提高饲料适口性。3.2日粮中添加玉米胚芽粕对藏羔羊瘤胃微生物丰富度与多样性的影响16S rDNA包含高度保守区，适合设计PCR通用引物，高通量测序技术可在短时间内实现大规模的平行测序。16S rDNA高通量测序技术可以快速高效地鉴定微生物种类和区系结构[13]。王祖艳等[14]采用不同添加剂处理全株玉米青贮，发现对奶牛瘤胃菌群Chao-1指数、Shannon指数和Simpson指数均具有极显著影响。本试验发现，试验组藏羊Ace指数、Chao-1指数与Shannon指数均显著高于对照组，表明玉米胚芽粕能够显著提高羔羊的瘤胃微生物丰富度和多样性。不同种类的细菌生理作用不同，健康的瘤胃微生物群落能够促进营养物质的消化吸收，维持胃肠道黏膜屏障功能，调节免疫系统。本试验发现，两组藏羔羊瘤胃细菌丰度、多样性均比较丰富，表明两组藏羔羊的瘤胃环境比较健康，日粮中添加玉米胚芽粕能够丰富藏羔羊瘤胃细菌群落。羔羊瘤胃微生物菌群发育受遗传、日粮、年龄及外界环境等因素影响[15]。其中，日粮营养水平及组成是影响反刍动物瘤胃发育的主要原因之一[16]。在奶牛瘤胃中，拟杆菌门和厚壁菌门比例较高[17]。马秀花等[18]在荞麦秸秆日粮中添加不同比例的甘露寡糖，研究发现，变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门是滩羊瘤胃的优势菌门，且添加2％甘露寡糖组厚壁菌门与拟杆菌门的相对丰度较高。本研究得到了相似的结果，但是对照组与试验组在门水平上优势菌无显著差异，可能是分类范围较广，无法区分两组的差异。添加玉米胚芽粕不会改变一般的优势菌群，是一种可替代部分常规原料。王玉强等[19]在泌乳奶牛日粮中添加6.80％的玉米胚芽粕，提高了黄色瘤胃球菌和溶纤维丁酸弧菌的菌群数量，促进瘤胃中纤维降解菌和蛋白降解菌的生长。本试验也得到了相似的结果，两组间普雷沃氏菌科、瘤胃球菌科、毛螺菌科、S24-7、韦荣氏菌科是优势菌，其中试验组藏羊毛螺菌科数量显著高于对照组。毛螺菌科可以发酵多种碳水化合物。本研究表明，添加玉米胚芽粕能够增加藏羔羊中发酵碳水的菌群，促进瘤胃降解多种碳水化合物，加快瘤胃消化饲料，促进羔羊的生长发育，提高经济效益。哺乳前山羊羔羊的瘤胃优势菌门是厚壁菌，在哺乳后拟杆菌门变成优势菌门。Li等[20]研究表明，犊牛在14~42日龄期间，拟杆菌门的相对丰度由45.7%增至74.8%，成为优势菌；而厚壁菌门的相对丰度在这一时期减少。本研究表明，3月龄藏羔羊瘤胃定植的优势菌是拟杆菌门与厚壁菌门，与前人的研究结果相似，不同的是后壁菌门在饲喂后期依旧保持优势，分析原因可能与厚壁菌门的功能有关。Liu等[21]研究表明，厚壁菌门可降解玉米胚芽粕中的粗纤维，在瘤胃中依然是优势菌。4结论日粮中添加玉米胚芽粕能够显著提高藏羔羊末重和平均日增重，显著改善瘤胃菌群丰富度与多样性。