无花果（Ficus carica Linn.）为桑科榕族榕属的落叶灌木，是一种具有较高的药用、食用价值的药食同源果品[1]。无花果中苹果酸、柠檬酸、脂肪酶等能够提高动物对日粮的消化吸收，促进食欲，润肠通便[2-4]，对促进动物生长发育、提高生产性能有利[5-6]。无花果还含有酚类化合物、植物甾醇、多糖、三萜、香豆素等活性成分[7-9]，具有抗肿瘤[10]、抗氧化[11]、调控糖代谢[12]等药理作用，对动物肠炎、腹泻等疾病具有特定的疗效[13]；其中酚类化合物具有调节免疫活性，改善心血管功能等多重药理活性[14-15]。目前关于酚类化合物的研究多集中于不同果实中酚类化合物提取及其功能性。如Jovanović等[16]研究不同超声辅助提取条件对野生百里香提取物多酚、黄酮含量和抗氧化活性的影响，HPLC定性定量分析。Li等[17]确定了板栗壳多酚的最佳提取条件及其多酚含量。Bedrettin等[18]研究了东方鸢尾多酚含量及抗氧化、抗菌、DNA保护作用等。本研究以无花果干果为原料，提取多酚，经过纯化后利用傅里叶红外吸收光谱分析（FTIR）、高效液相色谱分析（HPLC），鉴定无花果多酚物质的组成成分，对其多酚化合物进行抗氧化活性和抑菌活性研究，以期为无花果中多酚类化合物的综合利用提供参考。1材料与方法1.1试验材料无花果购自锦州市中药材场。1.2试验试剂福林-酚、没食子酸（北京索莱宝科技有限公司）；儿茶素、阿魏酸（成都麦德生科技有限公司）；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2'-联氨-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）（sigma公司）；维生素C（VC）、甲醇（色谱纯）、磷酸（色谱纯）（Thermo Fisher公司）；二甲基亚砜（天津市津东天正精细化学试剂厂）、卡那霉素（华畜制药）。牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂（北京奥博兴生物技术有限公司）；大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌（锦州医科大学食品与健康学院实验室）；无水乙醇、Na2CO3、溴化钾、PBS、K3[Fe(CN)6]、三氯乙酸、FeCl3、过硫酸钾均为分析纯。1.3试验仪器UV-5100B紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）、GT SONIC-P6超声波清洗器（上海贤德实验仪器有限公司）、XD-52AA旋转蒸发器（上海贤德实验仪器有限公司）、HR/T20MM立式高速冷冻离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）、K2025高效液相色谱仪（山东悟空仪器有限公司）、YLTG-10A冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）、KY9600傅里叶变换红外光谱仪（天津港东科技股份有限公司）、XFS-280CB高压蒸汽灭菌锅（上海尚仪仪器设备有限公司）、ZHJH-1112超净工作台（上海智城分析仪器制造有限公司）、WDP-9062电热恒温培养箱（上海安亭科学仪器有限公司）。1.4测定指标及方法1.4.1无花果多酚粗提液的制备按照参考文献[19]最佳提取工艺参数稍做改动，准确称取干燥后的无花果干粉末10.00 g，以1∶20 g/mL的料液比加入60%乙醇，充分溶解。采用超声波辅助法提取，重复提取3次，设置超声条件为：150 W、温度50 ℃、时间50 min。超声辅助提取完成后，将样品乙醇混合溶液置于离心机中，4 000 r/min离心10 min，取上清液。利用旋转蒸发仪真空浓缩大约至10 mL，蒸馏水1∶10等比例稀释，得到无花果粗多酚提取液。4 ℃冰箱避光保存。1.4.2无花果多酚粗提液的纯化参照文献[20-21]方法，将1.4.1中制得的无花果多酚粗提物除杂（料液比1∶1 g/mL，4 ℃条件下静置24 h），选择AB-8型大孔树脂动态吸附纯化无花果多酚粗提液，精准称取AB-8型大孔树脂10.00 g，加入除杂后的无花果多酚粗提液，上样设置温度25 ℃、流速0.5 BV/h下振荡24 h，进行动态饱和吸附，吸附平衡后测定上清液中的总酚含量。抽滤去除上清液，同样条件下改变流速1.0 BV/h洗脱24 h，得到纯化后的无花果多酚提取物，测定总多酚含量。无花果多酚提纯产物纯度为42.36%，4 ℃冰箱避光保存，用于鉴定多酚及其抗氧化活性、抑菌活性。1.4.3无花果总酚含量的测定总酚含量的测定参考文献[22]至文献[23]方法稍做改动，配制0.1 g/mL没食子酸标准溶液，移取不同浓度的没食子酸标准溶液于25 mL试管，向各试管中加入3.0 mL福林-酚试剂，混合摇匀需静置30 s。向各个试管中加入6.0 mL 20% Na2CO3溶液，加入蒸馏水定容至25 mL，摇匀，25 ℃避光放置2 h，以0样为空白，在波长765 nm处测量吸光度。以没食子酸标准溶液稀释不同浓度为横坐标，溶液吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线为y=0.982 9x+0.017 6（R2=0.992 4）。取1.0 mL无花果提取物，测定样品中总多酚的含量和上述绘制标准曲线方法相同，以没食子酸计。1.4.4无花果多酚的傅里叶变换红外光谱分析将纯化后的无花果多酚样品置于真空冷冻干燥机干燥至粉末状与适量KBr粉末放入玛瑙研钵中研磨混匀，放入手动加压机中压片制样；先进行背景采样，将压制好的薄片置于扫描范围4 000~400 cm-1；分辨率4 cm-1，傅里叶变换红外光谱仪中检测，扫描50次[24]。1.4.5无花果多酚的HPLC分析将无花果多酚纯化液用超纯水稀释到一定比例，使用0.22 μm微孔滤膜过滤至进样瓶中，进行HPLC分析。使用50%甲醇配制成不同质量浓度的没食子酸、儿茶素、阿魏酸标准溶液，稀释好的标准曲线溶液过0.22 μm的滤膜，应用色谱条件进行分析。以峰面积外标法进行定量，标准品质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。取适量质量浓度的标准品溶液各100 μL制成混合标准溶液与样品进行对照。色谱条件：样品色谱柱为SilGreen C18 柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），自动进样器进样，等比洗脱45%甲醇（流动相A）、55% 0.1%磷酸-水（流动相B），流动相使用前用0.45 μm有机滤膜过滤；流动相流速：1 mL/min，柱温：30 ℃，进样量：10 μL，运行时间20 min，紫外检测波长：280、320 nm[25-27]。1.4.6无花果多酚抗氧化活性1.4.6.1总还原力总还原力的测定参考文献[28]的方法稍做改动，试验组取不同梯度稀释浓度2 mL无花果多酚于离心管中，加2 mL磷酸缓冲溶液（PBS pH值为6.6）和2 mL六氰合铁酸钾混匀，50 ℃恒温水浴20 min，室温放置，加入2 mL 10%三氯乙酸，4 000 r/min离心10 min，取上清液2.5 mL，加入2 mL蒸馏水和0.3 mL 0.1% FeCl3，在波长700 nm处测量吸光度；处理方法与上述方法相同，蒸馏水为阴性对照；VC为阳性对照。还原能力以吸光度判定。1.4.6.2DPPH·清除能力DPPH·清除能力的测定参考文献[29]-文献[31]方法稍做改动，取0.05 mL不同梯度稀释浓度的无花果多酚，加入0.1 mmol/L DPPH无水乙醇溶液2 mL，混匀，在室温条件下避光静置30 min，在波长517 nm处测量吸光度；处理方法与上述方法相同，蒸馏水为阴性对照；VC为阳性对照。DPPH·清除率=(A2-A1)A2×100%(1)式中：A1为样品吸光值；A2为阴性对照吸光值。1.4.6.3ABTS+·清除能力ABTS+·清除能力参照李楠楠等[32]的方法稍做改动，配制ABTS+·溶液：0.02 g的ABTS与5 mL 2.4 mmol/L的过硫酸钾溶液混匀，在室温条件下避光静置12 h，取1.6 mL混合溶液定容至100 mL；取不同梯度稀释浓度0.1 mL无花果多酚，分别加入4.0 mL ABTS+·工作液，室温避光的条件下处理40 min，在波长734 nm处测量吸光度；处理方法与上述方法相同，蒸馏水为阴性对照；VC为阳性对照。ABTS+·清除率=(A0-A)A×100%(2)式中：A0为阴性对照吸光值；A为样品吸光值。1.4.7无花果多酚多酚抑菌活性1.4.7.1滤纸片法测定抑菌圈将活化好的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌用无菌水分别稀释为106 CFU/mL（600 nm处OD值约为1）的菌悬液。配制牛肉膏蛋白胨培养基在121 ℃条件下灭菌30 min，放置50 ℃左右时在无菌条件下倒入无菌培养皿中，水平放置待凝固制成平板。吸取0.1 mL各菌悬液加入平板中，采用无菌“三角式”涂布棒涂布均匀。无菌的镊子夹取直径大小为5 mm的滤纸片贴在含菌液平板上，每个平板均匀贴3片滤纸片。一片滤纸片为空白对照，另两片滤纸片上移取10 μL无花果多酚，37 ℃培养24 h，观察抑菌圈大小，每组试验重复3次[33]。1.4.7.2最低抑菌浓度（MIC）肉汤稀释法：对出现抑菌圈的微生物测定MIC值，取7只无菌试管，将无花果多酚采用两倍稀释法进行稀释，稀释浓度各为5.000 0、2.500 0、1.250 0、0.625 0、0.312 5 g/L。加入100 μL不同菌种悬液，吸取1 mL不同浓度多酚样品溶液于试管中，再加入1 mL液体培养基，37 ℃恒温培养24 h。设置阴性对照组加入DMSO，设置阳性对照组加入卡纳霉素，每组试验重复3次。培养24 h进行观察，将无菌体生长的最低无花果多酚浓度作为MIC[34]。1.4.7.3最低致死浓度（MBC）MIC试验的测定结束后，从不出现任何浑浊的试管中吸取1 mL液体，加入固体平板培养基，37 ℃恒温培养24 h观察，在固体平板培养基中未出现微生物菌落生长的最低无花果多酚纯化物为MBC[35]。1.5数据统计与分析试验数据采用Excel 2010软件进行处理，Origin软件绘图，SPSS 23.0软件进行差异显著性、IC50分析，Pearson Correlation Coefficient等方法相关性分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1无花果多酚的红外光谱分析（见图1）由图1可知，无花果多酚在3 650~3 100 cm-1处为羟基O—H引起的伸缩振动吸收峰，是酚类物质的主要特征；在2 950~2 904 cm-1处和在2 100~2 001 cm-1处为C—H引起的伸缩振动吸收峰和面外变形振动吸收峰；在1 700~1 400 cm-1处有多个明显吸收峰，该范围吸收峰特征表明具有芳香族特性，在1 695 cm-1左右为共轭羰基C=O伸缩振动吸收峰，在1 600~1 400 cm-1处为C=C（芳香族环骨架）引起的伸缩振动吸收峰以及酚羟基等苯环的特征；在873~831 cm-1处引起的伸缩振动吸收峰判定为由糖苷键引起。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.020.F001图1无花果多酚红外光谱分析综上所述，可分析出无花果多酚含有多酚羟基、C—H、羰基、芳香族环骨架、糖苷键等物质[36-37]。2.2无花果多酚的HPLC分析（见图2、图3、表1）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.020.F002图23种多酚混合标准品HPLC图谱注：1为没食子酸，2为儿茶素，3为阿魏酸；图3与此同。经过HPLC分析，3种标准品分别在280和320 nm波长下进行测定的色谱图与无花果多酚样品的HPLC分析色谱图。没食子酸、儿茶素、阿魏酸等3种标准品进行线性回归分析，建立标准曲线见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.020.T001表1标品测定标准曲线组别保留时间/min标准曲线决定系数线性范围/(g/L)没食子酸1.908y=19.726 7x+162.130 20.998 60~0.2儿茶素2.048y=7.083 8x+65.274 10.995 80~0.2阿魏酸4.190y=58.576 8x+248.802 30.994 70~0.2经处理得出，样品中只检出两种物质，其中没食子酸含量为2.873 mg/L、儿茶素含量为42.013 mg/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.020.F003图3无花果多酚HPLC图谱2.3无花果多酚抗氧化活性2.3.1无花果多酚总还原力（见图4）由图4可知，无花果多酚的还原力虽略低于VC，但曲线邻近，因此，无花果多酚的总还原能力与VC接近，具有较强的还原能力。当多酚质量浓度达到0.1 g/L时，吸光度高达1.11，无花果多酚与VC总还原能力差异性不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.020.F004图4无花果多酚总还原力2.3.2DPPH·清除能力的测定（见图5）由图5可知，VC和无花果多酚两者均具有较好的DPPH·清除能力，且清除能力随着质量浓度的增加逐渐增强，无花果多酚的DPPH·清除能力与VC接近。当质量浓度达到0.25 g/L时，无花果多酚和VC的清除能力高达90.57%和87.06%，无花果多酚与VC的DPPH·清除能力差异性不显著（P0.05）；无花果多酚和VC清除DPPH·的IC50值分别为0.090和0.065 g/L，二者差异不显著（P0.05）。由于无花果多酚经提取和纯化的过程中纯度升高使其抗氧化活性物质变高[38]；因此，无花果多酚的清除能力稍高于VC。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.020.F005图5无花果多酚DPPH·清除能力2.3.3ABTS+·清除能力的测定（见图6）由图6可知，当质量浓度达到0.25 g/L时，无花果多酚和VC的清除率高达80.02%和85.28%，无花果多酚与VC的ABTS+·清除能力差异不显著（P0.05）；无花果多酚和VC清除ABTS+·的IC50值分别为0.143和0.122 g/L，无花果多酚ABTS+·的IC50值显著高于VC（P0.05）。研究表明，VC和无花果多酚均具有较好的ABTS+·清除能力，且清除能力呈剂量依赖性，随着质量浓度的增加而提高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.020.F006图6无花果多酚ABTS+·清除能力由于VC自身抗氧化清除能力很强，分析无花果多酚可能与其他物质反应导致清除能力略低于VC。无花果多酚的ABTS+·清除能力与VC相近。2.4无花果多酚抑菌活性2.4.1滤纸片法测定抑菌圈（见图7、表2）由图7和表2分析可知，无花果多酚对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌出现明显抑菌圈，以十字法交叉法测量抑菌圈大小，无花果多酚对试验菌种抑制能力由大到小为：枯草芽孢杆菌大肠杆菌金黄色葡萄球菌，表明无花果多酚具有抑菌活性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.020.F007图7无花果多酚抑菌活性10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.020.T002表2无花果多酚对菌种的抑菌圈直径组别大肠杆菌枯草芽孢杆菌金黄色葡萄球菌空白对照———无花果多酚10.42±1.3010.95±0.709.96±1.10注：“—”表示未检出。mm2.4.2无花果多酚的MIC和MBC（见表3、表4）MIC和MBC的浓度值越小，表明抑菌活性越强，在低浓度下即可完全抑制微生物的生长或杀灭微生物。由表3、表4可知，阴性对照DMSO未显出抑制生长或杀灭微生物的作用，而阳性对照卡那霉素具有强抑制生长或杀灭微生物作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.020.T003表3无花果多酚的MIC项目无花果多酚/(g/L)阴性对照阳性对照5.000 02.500 01.250 00.625 00.312 5大肠杆菌++++——+枯草芽孢杆菌++++——+金黄色葡萄球菌+++———+注：“+”表示有抑菌效果；“—”表示无抑菌效果。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.020.T004表4无花果多酚的MBC项目无花果多酚/(g/L)阴性对照阳性对照5.000 02.500 01.250 00.625 0大肠杆菌++++—+枯草芽孢杆菌+++——+金黄色葡萄球菌+++——+无花果多酚对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的MIC分别为0.625 0、0.625 0、1.250 0 g/L，MBC分别为0.625 0、1.250 0、1.250 0 g/L，无花果多酚对不同菌种的抑制活性有多样性，与抑菌圈试验结果一致，均具有明显的抑制或杀灭作用。3讨论植物多酚类物质是一种天然、健康、绿色、安全的饲料添加剂，可直接影响动物的生长和肌肉品质。肖红艳等[39]研究发现，在日粮中添加茶多酚可提高奶山羊产奶的质量，提高奶山羊的抗氧化功能。孙廷等[40]在商品猪日粮中加入不同剂量植物多酚，可显著提高育肥猪重量、猪肉品质和饲料效率。本试验提取的无花果多酚，经过傅里叶红外吸收光谱法、高效液相色谱法鉴定了无花果多酚组成成分，并对其进行定性定量分析，多方面考察无花果多酚的抑菌活性。本试验结果与上述试验相比，多酚物质提取率略低，原因可能是原料和可溶性固形物不同，具有显著差异性。但无花果多酚可诱导提高动物的血清白细胞吞噬活性、血清杀菌活性、溶菌酶活性、超氧化物歧化酶活性和总蛋白、补体C3含量[41-43]。4结论本研究提取的无花果多酚化合物，经过纯化后进行傅里叶红外吸收光谱法、高效液相色谱法进行组成成分分析，红外光谱分析结果表明，无花果多酚含有多酚羟基、C—H、羰基、芳香族环骨架、糖苷键等物质；通过高效液相色谱鉴定，无花果多酚含有没食子酸、儿茶素等2种酚类化合物，其中没食子酸含量为2.873 mg/L，儿茶素含量为42.013 mg/L。无花果多酚具有较强的还原能力，DPPH和ABTS清除能力的IC50值分别为0.090、0.143 g/L。无花果多酚对试验菌种抑制能力排序为：枯草芽孢杆菌大肠杆菌金黄色葡萄球菌，无花果多酚对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的MIC分别为0.625 0、0.625 0、1.250 0 g/L，MBC分别为0.625 0、1.250 0、1.250 0 g/L，表明无花果多酚纯化提取物具有较强抑菌活性。