畜禽养殖过程规范化使用抗生素可降低动物的患病率和病死率[1-2]，但长期、大量使用抗生素可能导致耐药菌株出现[3-4]，破坏畜禽肠道内的微生态平衡[5]，间接威胁人类健康[6-8]。因此，需要寻找绿色、安全、高效的抗生素替代品。丁酸属于酸化剂类抗生素替代品，具有调节动物胃肠道机能、pH值及微生态菌群平衡等作用[9-10]。丁酸为油状液体，易挥发且气味刺鼻，不利于直接饲喂[11]。丁酸盐稳定但无法到达大肠且存在脂臭味[12]，更适合在幼龄动物中应用[13]。三丁酸甘油酯几乎无味或略有芳香气味[12,14]，安全无毒副作用[15]，可被动物肠道内的胰脂肪酶催化释放丁酸，进而提高动物生长性能[16]。长期保存的三丁酸甘油酯存在奶酪酸败样气味，直接饲喂影响适口性[13]。微囊化的三丁酸甘油酯具有可去除异味、增强稳定性、保护生物活性[13]等功能。微囊化三丁酸甘油酯含量较低，使三丁酸甘油酯在实际生产和应用中受到一定限制。本文研究三丁酸甘油酯的最佳合成条件、检测方法和微囊化工艺，合成纯度较高的三丁酸甘油酯，旨在解决丁酸添加和三丁酸甘油酯味苦等问题，使三丁酸甘油酯更好地在饲料生产中应用。1材料与方法1.1试验材料三丁酸甘油酯合成试剂：丁酸、甘油、磷酸、碳酸氢钠、硫酸钙、二氧化硅、硫酸锌、硫酸钡、二氧化钛、磷酸二氢钾、浓硫酸、水、石油醚、三丁酸甘油酯均为国药试剂。气相色谱试剂：吡啶、十四烷、N,O-双三甲基硅三氟乙酰胺（BSTFA）、三甲基氯硅烷（TMCS）、甘油标准品、三丁酸甘油酯标准品（纯度不低于99%）、甘油标准品（纯度不低于99%）。色谱柱：填料为5%苯基，1%乙烯基-甲基聚硅氧烷，柱长30 m，内径0.25 mm，涂膜厚度0.25 μm，或等效色谱柱。三丁酸甘油酯微囊化试剂：三丁酸甘油酯、水、抗性糊精、二氧化硅、玉米糖浆、单双脂肪酸甘油酯、聚甘油酯、氢化植物油、磷酸二氢钾、酪蛋白酸钠、奶味香精均为国药试剂。1.2试验仪器电热套、四口玻璃烧瓶、回流装置、蒸馏装置、分液漏斗、旋转蒸发仪、抽滤瓶、真空泵（上海实验室仪器厂有限公司）。微量进样器、GC2014-C气相色谱仪（岛津实验器材有限公司）、氢火焰离子化检测器（FID）。Bruker AvanceⅡ-400 MHz型核磁共振谱仪（溶剂DMSO-d6，TMS为内标）。1.3测定指标及方法1.3.1三丁酸甘油酯的制备甘油和丁酸按照物质的量的比为1∶4，自制固体催化剂的添加量为总投料质量的0.1%，加入5 L的四口玻璃烧瓶，安装温度计、分水装置、置换空气氮保反应装置、电动搅拌装置。开启电动搅拌，测试搅拌转速对反应速度和转化率的影响。加热升温回流，时刻观察温度计温度，温度不再上升且无水生成时停止反应。降温后，减压蒸馏未反应的丁酸，制得粗产物，过滤回收催化剂。在分液漏斗中使用饱和碳酸氢钠水溶液多次水洗粗产物，去除未反应的丁酸，直至水层为中性。上层液体从分液漏斗上端倒出，利用旋转蒸发仪减压蒸馏，去除残留的水，冷却，减压抽滤，滤液为较高纯度的三丁酸甘油酯。1.3.2三丁酸甘油酯的合成方法优化以甘油和丁酸为原料合成三丁酸甘油酯的过程属于可逆的酯化反应，分别对物料比、搅拌设备、催化剂等因素进行优化，有利于提高反应的转化率。3CH3CH2CH2COOH+C3H8O3=C15H26O6+3H2O1.3.2.1物质的量的比对反应的影响根据酯化反应可逆的特点，投入过量的丁酸有助于反应向生成三丁酸甘油酯的方向进行，从而提高转化率。将甘油与丁酸分别按照1∶3.0、1∶3.5、1∶4.0、1∶4.5、1∶5.0的物质的量的比进行反应，观察反应是否彻底。1.3.2.2搅拌对反应的影响甘油和丁酸的密度相差较大，互溶性较差。为提高反应产率，分别对搅拌类型和搅拌速度进行试验。根据锚式搅拌、螺旋搅拌和浆式搅拌三种搅拌方式的优缺点及本试验的具体情况，最终选择锚式搅拌。对于锚式搅拌，搅拌速度由100、200、300、400、500、600、700、800、900、1 000 r/min进行试验，观察反应完全所用的时间。1.3.2.3催化剂对反应的影响常规催化剂（浓度为98.5%硫酸、85%磷酸）不能重复使用，反应过程中容易碳化，对催化剂进行中和导致大量无机盐产生造成环境污染。本试验采用自制催化剂，将硫酸钙、二氧化硅、硫酸锌、硫酸钡、二氧化钛、氧化铝，按照物质的量的比为1∶2∶2∶2.5∶1∶2混合，硫酸浸泡24 h，800 ℃灼烧12 h，研磨，粉碎至200目。自制催化剂的添加量为总投料质量的0.1%，反应结束直接过滤回收，观察反应的转化率。1.3.3三丁酸甘油酯微囊化工艺流程三丁酸甘油酯微胶囊粉末制备采用喷雾干燥法。三丁酸甘油酯微囊粉末物料配比见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.019.T001表1三丁酸甘油酯微囊粉末物料配比配料名称添加量配料名称添加量三丁酸甘油酯43.6聚甘油酯1.8水23.6氢化植物油3.9抗性糊精5.8磷酸二氢钾1.5二氧化硅4.4酪蛋白酸钠0.7玉米糖浆（50%）7.3奶味香精0.1单双脂肪酸甘油酯7.3%工艺流程：将原料按照表1的比例升温至85 ℃熔化→搅拌混合→高压均质→喷雾干燥→成品→筛分。喷雾干燥工艺参数：进风温度150 ℃、出风温度70 ℃、喷头转速400 Hz、进样速率15 Hz，制成微胶囊粉末。1.3.4气相色谱法测定三丁酸甘油酯含量1.3.4.1标样及试样制备称取十四烷（内标物）和相应标准品各100 mg，置于10 mL容量瓶，使用吡啶定容作为标样溶液。标准品包含甘油和待测物对应的单甘油脂肪酸酯。量取0.10 mL标样溶液于2.5 mL螺旋盖样品瓶，加入0.1 mL TMCS和0.2 mL BSTFA，摇匀，70 ℃烘箱反应20 min，得标样。称取100 mg十四烷（内标物）和600 mg试样，置于10 mL容量瓶，使用吡啶定容。量取0.10 mL溶液于2.5 mL螺旋盖样品瓶，加入0.1 mL TMCS和0.2 mL BSTFA，摇匀，70 ℃烘箱反应20 min，得待测试液。1.3.4.2测定条件进样条件：柱温：初温120 ℃，以15 ℃/min的速率升温至340 ℃，维持4 min；进样口温度：320 ℃；检测器温度：350 ℃。载气：氮气，载气流速：1 mL/min。氢气：60 mL/min，空气：500 mL/min，分流比：1∶50，进样量1 μL。相对校正因子按式（1）计算：fi=mi×Asms×Ai (1)式中：Ai、As组分物质i和标准物质s的峰面积，mi、ms为组分物质i和标准物质s的质量（g）。待测组分的质量分数ωi按式（2）计算：ωi=mim=fi×Aifs×As×msm=fi×Ai×msAs×m×10000 (2)式中：Ai、As为组分物质i和标准物质s的峰面积；m为称取的试样质量（g）；ms为内标物质的质量（g）；fi为相对校正因子；ωi为待测组分的质量分数。1.3.5滴定法测定三丁酸甘油酯含量参照GB/T 14455.6—2008，对样品进行酯值测定，计算三丁酸甘油酯的酯化率。1.3.6三丁酸甘油酯微囊化含量测定准确称取包埋好的三丁酸甘油酯微囊粉0.500 0~0.600 0 g，参照GB/T 1886.65—2015中的检测方法，利用外标法进行检测。1.3.7三丁酸甘油酯微囊化包埋率检测精确称取2.000 0~3.000 0 g（m）的三丁酸甘油酯微胶囊粉末产品，轻微搅拌，利用40 mL石油醚准确浸提1 min，过滤，使用25 mL石油醚再次洗涤，合并滤液，利用旋转蒸发仪蒸干，65 ℃真空烘干至恒重（m1）。计算包埋率。x=m×60%-m1m×60% (3)式中：x为包埋率（%）；m为样品质量（g）；m1为真空烘干的质量（g）。2结果与分析2.1三丁酸甘油酯的合成方法的最优条件2.1.1物质的量的比对反应的影响研究表明，在甘油物质的量一定的情况下，丁酸投入量过少，反应进行不彻底，反应转化率较低；甘油与丁酸物质的量的比为1∶4.0时，反应转化率最高，但丁酸投入量过大可能造成不必要的能源浪费，增大蒸馏负担。因此，本试验甘油与丁酸的物质的量的比为1∶4.0。2.1.2搅拌对反应的影响研究表明，促进反应效果排序为锚式搅拌螺旋搅拌浆式搅拌。选择锚式搅拌，将锚式搅拌速度由100 r/min提高至800 r/min，发现反应完全时间由8 h降至6 h；继续提升搅拌速度至1 000 r/min，电机阻力明显增大，反应系统共振严重，不利于反应顺利进行。因此，试验选择锚式搅拌，速度为800 r/min。2.1.3催化剂对反应的影响试验结果发现，自制催化剂反复使用至第10次的催化效率仍基本不变，10次反应转化率均保持在95%以上（浓硫酸作为催化剂，反应的转化率为88%）。2.2三丁酸甘油酯表征测定结果（见图1、图2）1H-NMR在400 MHz下测定，13C-NMR在101 MHz下测定。三丁酸甘油酯核磁共振1H谱、13C谱见图1、图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.019.F001图1三丁酸甘油酯核磁共振1H谱10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.019.F002图2三丁酸甘油酯的核磁共振13C谱具体结构表征数据如下：1H-NMR（400 MHz，DMSO－d6）：δ（mg/kg）：5.15（m，1H，—CH—），4.32（d，2H，α-OC(=O)—C），2.25（t，2H，α-C(=O)O—C），1.72（m，2H，β-C(=O)O—C），0.96（t，3H，β-CH3）；13C-NMR(101 MHz）δ（mg/kg）：173.1（C=O），69.1（—CH—，α-O—C=O），64.2（—CH2—，α-O—C=O），36.1（—CH2—，α-C(=O)—O），18.4（—CH2—，β-C(=O)—O），13.5（—CH3）；m/e：302.173（100.0%），303.176（16.2%），304.177（1.2%），304.180（1.2%）。2.3气相色谱法测定三丁酸甘油酯的含量经测定三丁酸甘油酯的质量分数为98.6%，游离甘油的质量分数为1.1%。三丁酸甘油酯的气相色谱见图3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.019.F003图3三丁酸甘油酯的气相色谱2.4滴定法测定三丁酸甘油酯含量经计算酯化率为99.2%。两种检测方法测定的三丁酸甘油酯含量见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.019.T002表2两种检测方法测定的三丁酸甘油酯含量方法结果气相色谱法98.6滴定法99.2%由表2可知，两种检测方法测定的含量基本一致，表明气相检测法符合试验要求。2.5三丁酸甘油酯微囊化含量测定结果经计算，3次平行检测结果分别为59.85%、60.12%、60.48%，检测结果基本一致，表明三丁酸甘油酯微囊粉包埋均匀一致性良好。2.6三丁酸甘油酯微囊化包埋率检测结果计算结果表明，包埋率为99.6%。产品包埋效果较好，能够有效掩盖三丁酸甘油酯入口的苦味，增强动物入口的适口性，改善三丁酸甘油酯味苦的缺点。3讨论目前，合成三丁酸甘油酯的方法主要包括：丁酰氯与甘油反应（CN104045556A）[17]，PVC树脂负载杂多酸的催化剂制备[18]，过量丁酸与甘油在催化剂作用下生成三丁酸甘油酯（CN107373094A）、精馏[19-20]或采用活性炭进行脱色处理[21]等。部分方法转化率低、副产物多[17]，也有部分方法成本高、产品纯度不够、色度不足[21]、不易储存，原料受管控[19]。本试验优合成条件为甘油和丁酸物质的量的比为1∶4.0，自制固体催化剂用量为0.1%，转速800 r/min锚式搅拌，三丁酸甘油酯无色透明，两种检测方法的检测含量高达95%，且试验发现自制催化剂反复使用至第10次催化效率仍基本不变，10次反应转化率均保持在95%以上（而由浓硫酸作为催化剂，此反应的转化率为88%）。本试验方法转化率高、副产物少、易操作、不用脱色，解决了成本高的问题。4结论本试验在最优条件下合成的三丁酸甘油酯产品无色透明、酯化率高，生产过程绿色无毒害。对三丁酸甘油酯产品按照本试验方法进行微囊化，检测发现包埋的三丁酸甘油酯颗粒均一、包埋率高，解决了丁酸为液态难以添加的特点，改善了三丁酸甘油酯味苦的缺点。