高温制粒能够杀死全混合日粮（TMR）中的有害菌，有助于降低家畜消化系统疾病的发病率，提高动物机体免疫功能。颗粒化还可以改善日粮的适口性，减少家畜挑食的现象，提高日粮的利用率，改善动物的生产性能。李刚[1]研究发现，与传统饲喂模式相比，饲喂颗粒型TMR可提高杜蒙肉羊的生长性能。候沛君等[2]研究发现，与散状TMR相比，颗粒型TMR可以改善湖羊的瘤胃功能和生长性能，提高养殖经济效益。在日粮中添加益生菌可明显提升畜禽的生长性能，提高免疫机能及繁殖性能，进一步改善养殖环境，有助于提高肉品质[3-4]。益生菌的常用添加方式包括普通料拌服[5]、青贮饲料发酵[6]及微胶囊包埋[7]等。有研究使用喷涂技术添加益生菌，但现有报道主要集中在水产类饵料的生产中[7-9]，使用喷涂技术生产反刍动物含益生菌颗粒饲料的报道较少。本研究以育肥牛全混合日粮为基础饲料，以市售植物乳杆菌制剂为添加剂，通过3种不同的加工方法制成有效活菌数约107 CFU/g的颗粒型全混合日粮，研究不同加工方式对益生菌活性的影响；利用2种不同外包装封装生产的含益生菌颗粒饲料，分别置于2种不同温度环境下贮存，研究不同贮存条件对饲料中益生菌活性的影响，旨在为生产含益生菌的颗粒反刍饲料提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1益生菌制剂本研究选用的植物乳杆菌制剂购自湖北宜昌安琪酵母股份有限公司，有效活菌数≥1×107 CFU/g。1.1.2培养基MRS培养基和改良MC培养基均购自青岛海博生物技术有限公司。1.1.3试验日粮试验使用的全混合日粮按照10月龄肉牛育肥所需的营养水平配制。基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.019.T001表1基础日粮组成及营养水平（风干基础）原料组成含量/%营养水平合计100.0玉米30.0消化能/(MJ/kg)12.71麸皮8.0粗蛋白/%15.28大豆粕15.0粗脂肪/%2.73菜籽饼5.0粗纤维/%6.52玉米青贮25.0粗灰分/%6.30苜蓿干草11.0无氮浸出物/%40.75碳酸氢钙0.5钙/%0.54食盐0.5总磷/%0.38预混料5.0注：1.预混料为每千克日粮提供：VA 2 500 IU、VD 300 IU、VE 50 IU、铜20 mg、铁22 mg、锌60 mg、碘0.8 mg、硒0.2 mg、钴0.4 mg。2.营养水平中消化能为计算值，其余均为实测值。1.1.4试验仪器液体喷涂机、真空喷涂机（江苏牧羊集团有限公司）、中小型颗粒饲料机（无锡市天牧粮机有限公司）、超净工作台（山东博科生物产业有限公司）、恒温培养箱（上海博讯实业有限公司）、分光光度计（北京天石天力医疗器械技术开发中心）、细菌自动计数器（上海兰仪实业有限公司）。1.2试验地点饲料的配制、加工及贮存试验于张掖市金农源生物科技有限公司进行；饲料样品的检测在张掖市动物卫生监督所实验室进行。1.3试验方法1.3.1菌液的制备及生长曲线的绘制按照说明书活化菌体，制成活菌悬液，4 ℃保存。为保证菌体活性，使用中根据需求量现配现用。将活化的新鲜菌液按照体积比0.1%的接种量接种于MRS培养基，37 ℃培养36 h，前4 h内每隔1 h取样1次，之后每2 h取样1次，以无菌MRS培养基为对照，测定620 nm波长处的OD值，使用分光光度法绘制生长曲线[10]。对活化菌液进行10倍梯度稀释，参照《饲料添加剂植物乳杆菌》（T/CSWSL 005—2018）[11]中的方法进行活菌计数，使用活菌计数法绘制生长曲线[10]。1.3.2颗粒饲料的制备制备的全混合日粮充分粉碎，利用制粒机制成直径为3~4 mm的颗粒饲料[10]。控制制粒温度及风干时长，控制水分含量约12%[10]。1.3.3含益生菌颗粒饲料的制作将1.1.3配制的全混合日粮充分粉碎，按照说明书推荐用量（2 kg/t）喷洒1.3.1中活化的菌液，充分搅拌混合均匀，使用冷压制粒的方法制成第1种含益生菌颗粒饲料（方法Ⅰ）。将1.3.1中活化的菌液，通过液体喷涂机添加至1.3.2中制备的颗粒饲料中，制成第2种含益生菌颗粒饲料（方法Ⅱ），根据参考文献[12]并结合喷涂机推荐喷涂参数，控制菌液喷涂量约8%。将1.3.1中活化的菌液，通过真空喷涂机添加至1.3.2中制备的颗粒饲料中，制成第3种含益生菌颗粒饲料（方法Ⅲ），根据参考文献[13]并结合喷涂机推荐喷涂参数，控制喷涂量约8%。1.3.4加工前后益生菌活性的观察1.3.3中3种加工方式制成的含益生菌颗粒饲料，在加工后取5个批次的样品，参照《饲料中嗜酸乳杆菌的微生物学检验》（GB/T 20191—2006）中的检测方法进行活菌计数[14]，记为Mn。原始菌液参照上述检测方法进行活菌计数，记为M0。计算加工后饲料中植物乳杆菌的存活率。存活率(加工)=Mn/M0×100%(1)1.3.5不同条件贮存后益生菌存活率的观察将1.3.3中不同加工方式生产的含益生菌颗粒饲料，分别使用普通编织袋（包装Ⅰ）和真空包装袋（包装Ⅱ）进行封装，净含量为10 kg/袋。包装品置于低温（4~8 ℃）和室温（张掖市夏季平均气温为17~23 ℃）贮存60 d，取样分析，贮存期间保持遮光和通风条件一致。贮存过程每7 d取样1次，每个样本采集100 g饲料，每个不同的处理取10个样品。取样后参照《饲料中嗜酸乳杆菌的微生物学检验》（GB/T 20191—2006）中的检测方法进行活菌计数[14]，记为Wx。对包装前的饲料参照上述检测方法进行活菌计数，记为Wo。计算贮存后饲料中植物乳杆菌的存活率。存活率(贮存)=Wo/Wx×100%(2)2结果与分析2.1植物乳杆菌的生长曲线（见图1）以培养时间为横坐标，OD620 nm值和活菌含量的对数值分别为纵坐标，绘制植物乳杆菌的生长曲线。由图1可知，本试验植物乳杆菌制剂培养过程中，0~4 h为迟缓期，4~12 h为对数生长期，12~22 h为稳定期，22 h后为衰亡期。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.019.F001图1两种方法绘制植物乳杆菌的生长曲线2.2不同加工方法对益生菌活性的影响（见表2）由表2可知，制粒后普通液态喷涂添加和制粒后真空喷涂添加生产的饲料中，植物乳杆菌的存活率分别为84.02%和91.84%，添加植物乳杆菌后冷压制粒生产的颗粒饲料中，植物乳杆菌的存活率仅约42%，显著低于方法Ⅱ和方法Ⅲ（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.019.T002表2不同加工方式对益生菌活性的影响加工方法批次活菌数/(1×107 CFU/g)存活率/%平均存活率/%加工前加工后方法Ⅰ（添加益生菌后冷压制粒）19.853.7538.1541.68±5.41b29.634.3545.2639.113.8041.7248.873.4739.1559.354.1244.13方法Ⅱ（制粒后普通液态喷涂）18.837.1480.8684.02±5.38a29.478.2887.4339.128.3191.1249.657.6779.4358.917.2481.29方法Ⅲ（制粒后真空喷涂）19.278.5692.3891.84±7.14a28.698.1894.1639.458.2887.6549.168.2790.2958.898.4294.74注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.3不同包装封装低温（4~8 ℃）贮存的益生菌活性变化（见表3、表4）由表3可知，各方法生产的饲料使用包装Ⅰ封装，在低温条件下贮存，植物乳杆菌存活率下降50%的时间点分别为第3、第5和第6 w，此时有效活菌数的数量级均保持在104以上；第8 w，各方法生产饲料中植物乳杆菌的存活率分别为2.3%、15.4%和22.2%，此时有效活菌的数量级均维持较低水平。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.019.T003表3包装Ⅰ封装后低温（4~8 ℃）贮存益生菌活性的变化项目加工方法贮存时间/w012345678益生菌存活率/%方法Ⅰ42.6340.8734.3621.8417.2112.768.624.242.25方法Ⅱ84.1678.6172.1965.4357.5144.8735.1724.1715.37方法Ⅲ88.7982.4575.4368.7461.3553.7945.2931.5922.15有效活菌的对数值方法Ⅰ5.8315.3414.6564.4743.4453.1572.2171.6451.435方法Ⅱ6.7356.3356.2045.2384.9814.1633.8452.8422.228方法Ⅲ6.8676.5476.3845.7585.5144.8214.3273.5573.246由表4可知，各方法生产的饲料使用包装Ⅱ封装，在低温条件下贮存，植物乳杆菌的存活率下降50%的时间点分别为第5、第6和第6 w，此时有效活菌数的数量级约105；第8 w，各方法生产饲料中植物乳杆菌的存活率分别为6.6%、28.6%和35.6%，此时有效活菌的数量级均维持在104以上。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.019.T004表4包装Ⅱ封装后低温（4~8 ℃）贮存益生菌活性的变化项目加工方法贮存时间/w012345678益生菌存活率/%方法Ⅰ43.2141.2936.5431.4724.3620.5215.399.216.58方法Ⅱ85.1380.1378.2574.1364.2352.4841.3633.4828.56方法Ⅲ89.5685.4980.2676.4968.5154.3646.8939.7635.58有效活菌的对数值方法Ⅰ5.9265.4325.2195.4144.8934.6514.2524.1784.013方法Ⅱ6.7186.6356.2216.0185.7595.2155.1094.6744.483方法Ⅲ6.9216.8786.7356.4256.5676.2415.8735.7835.4152.4不同包装封装室温（17~23 ℃）贮存的益生菌活性变化（见表5、表6）由表5可知，各方法生产的饲料使用包装Ⅰ封装，在室温条件下贮存，植物乳杆菌的存活率下降50%的时间点分别为第2、第3和第4 w，此时有效活菌数的数量级分别为10、102和102；贮存至第5 w时，方法Ⅰ加工的饲料中已无植物乳杆菌存在；贮存至第6 w时，3种方法加工的饲料中均无植物乳杆菌存在。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.019.T005表5包装Ⅰ封装后室温（17~23 ℃）贮存益生菌活性的变化项目加工方法贮存时间/w0123456益生菌存活率/%方法Ⅰ42.4533.4216.316.283.8400方法Ⅱ84.1668.4355.4742.5623.158.540方法Ⅲ88.5472.1660.7251.8735.4614.170有效活菌的对数值方法Ⅰ5.7854.3871.8640.8630.22800方法Ⅱ6.6845.6944.4892.3471.1130.5620方法Ⅲ6.8346.1085.3623.6882.6531.0540由表6可知，各方法生产的饲料使用包装Ⅱ封装，在室温条件下贮存，植物乳杆菌存活率下降50%的时间点分别为第2、第4和第4 w，此时有效活菌数的数量级分别为104、103和104；贮存至第6 w时，方法Ⅰ加工的饲料中已无植物乳杆菌存在；贮存至第8 w时，方法Ⅱ和方法Ⅲ加工的饲料中均无植物乳杆菌存在。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.019.T006表6包装Ⅱ封装后室温（17~23 ℃）贮存益生菌活性的变化项目加工方法贮存时间/w012345678益生菌存活率/%方法Ⅰ42.8235.8422.6915.728.283.51000方法Ⅱ85.1477.8965.8156.4942.1620.1512.434.510方法Ⅲ89.3283.4772.0869.2148.3625.6416.847.630有效活菌的对数值方法Ⅰ5.8315.3414.1583.4561.5540.842000方法Ⅱ6.6256.2255.4265.0243.8192.1281.1540.7130方法Ⅲ6.8676.5175.9465.5524.2572.3671.8281.04503讨论3.1不同加工方式对益生菌活性的影响饲料中添加益生菌具有改变饲料适口性、增加动物采食量、降低养殖成本、提高养殖效益等优势。为了提高饲料中益生菌的活性，最大限度地发挥益生菌的作用，有研究尝试使用微胶囊包埋法[15]、黏附剂固定法、喷涂添加法[16-17]等加工方式制作含益生菌饲料，获得众多研究成果。本试验以植物乳杆菌为饲料添加剂，使用添加后冷压制粒、制粒后液态喷涂和制粒后真空喷涂等3种方法分别制作含益生菌的颗粒饲料，对制作前后饲料中植物乳杆菌的存活率进行检测。本试验结果发现，添加益生菌后冷压制粒方式生产的颗粒饲料中，植物乳杆菌的存活率约40%，表明与传统高温制粒相比，冷压制粒的生产工艺可避免高温环境对益生菌的损伤[18]。但低温制粒过程中受搓揉摩擦时间过长或受到机械挤压的影响，仍会损伤部分益生菌。制粒后喷涂益生菌生产的2种颗粒饲料中，植物乳杆菌的存活率均保持在80%以上，表明在制作含益生菌颗粒饲料的过程中，使用先制粒后喷涂添加益生菌的加工方法可有效保持饲料中益生菌的活性。真空喷涂添加益生菌的存活率大于普通液态喷涂益生菌的存活率，原因可能是使用液态喷涂添加可使大部分益生菌附着于饲料颗粒表面，后期封装、转运等操作中受摩擦、挤压的影响导致部分益生菌脱落流失；而真空喷涂过程中，益生菌分子受气压差的作用力挤压进入饲料颗粒的微孔内部[19]，较为稳定。3.2不同贮存条件对益生菌活性的影响碳源、氮源及生长因子等微观因素和温度、湿度及水分等宏观因素均会影响益生菌的活性[18,20]。益生菌活性是衡量含益生菌饲料架货期和质量的重要标准之一[20]。确保饲料中的益生菌在一定的保存期内保持稳定的活力，才可使含益生菌饲料在饲喂中发挥作用。通过优化贮存环境条件使益生菌尽可能长时间地保持活性、延长含益生菌饲料的架货期，是国内外学者研究的热点。王汗成等[7]研究发现，使用不同方法加工的含益生菌颗粒饲料在4 ℃贮存时，益生菌的活性较为稳定。有研究发现，使用密封性高的包装袋封装有利于饲料的长时间保存[21]。本研究对饲料进行封装，分别置于低温（4~8 ℃）和室温（17~23 ℃）环境下贮存，结果表明，低温条件下的饲料贮存8 w，益生菌仍可保持较好的活性，与益生菌在低温条件下新陈代谢减缓、可长期存活的生理特性相一致。本试验选用普通编织袋和真空包装袋对饲料进行封装贮存，结果表明，与普通编织袋封装相比，使用真空包装袋封装饲料中益生菌活性的下降速度的明显减缓；室温条件下贮存7 w时，真空包装袋封装的饲料中益生菌仍具有一定活性，原因可能是植物乳杆菌属于厌氧菌，真空包装后的缺氧环境有助于其长期保持稳定。含益生菌饲料的贮存应该在使用真空包装封装的同时置于低温环境条件，可更长时间保持其中益生菌的活性，有助于延长饲料的架货期，使饲料更好地发挥作用。针对生产企业和饲料用户，创造低温环境和使用真空包装在技术和设备方面均会增加成本投入；但对于集约化程度高、硬件设施完备的规模化养殖场则基本不会增加额外开支，可以接受；面对普通的养殖场（户），创造上述条件会增加成本投入，影响经济效益。因此，在现阶段饲料制粒技术、喷涂添加技术、物流配送较为成熟的背景下，为降低损耗、节约成本，建议在生产实践中发展“订单经济”，按照“现下单、现生产、现配送、现使用”模式进行示范推广。4结论使用制粒后喷涂添加益生菌的方法制作含益生菌颗粒饲料可以有效保持饲料中益生菌的活性，且真空喷涂的效果优于普通液态喷涂。生产含益生菌饲料时，使用真空包装封装并置于低温（4~8 ℃）条件下可有效延长饲料的货架期。